Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 4:00 min. • July 8th, 2025
O crescimento de neuritos - onde os neurônios desenvolvem projeções - é crucial para a função neural e regeneração.
Para avaliar os efeitos neurotóxicos dos compostos de teste promotores de crescimento de neuritos in vitro, obtenha uma suspensão de células progenitoras neurais humanas, hNPC, em meios de diferenciação.
Semeie as células em poços de placas de vários poços revestidos com poli-L-lisina e laminina, facilitando a ligação das células ao fundo do poço e apoiando o crescimento celular. Os constituintes do meio de diferenciação promovem a diferenciação de hNPC em neurônios.
Trate um conjunto de poços com composto de teste promotor de crescimento de neuritos. Isso interage com os neurônios derivados de hNPC e pode induzir o crescimento de neuritos, sem interromper os processos metabólicos celulares e a subsequente concentração de trifosfato de adenosina, ATP - a principal fonte de energia celular.
Adicione o reagente de etapa única contendo detergentes, enzima luciferase e substrato de luciferase, luciferina e inibidores de ATPase junto com íons de magnésio e misture.
Os detergentes rompem a membrana celular, resultando em lise celular e liberação intracelular de ATP na solução. Os inibidores da ATPase inibem a ATPase endógena liberada, o que pode interferir na medição de ATP. Centrífuga, sedimentando detritos celulares.
Durante a incubação, o ATP liberado com íons de magnésio faz com que a luciferina se ligue à luciferase, resultando na oxidação da luciferina em oxiluciferina altamente excitada, emitindo um fóton bioluminescente após o relaxamento ao seu estado fundamental. Usando um leitor de microplacas, meça a luminescência, indicativa da concentração de ATP.
Maior concentração de ATP representa maior viabilidade celular, sugerindo que não há toxicidade significativa do composto de teste nos neurônios.
Para revestir a placa, adicione 30 microlitros de poli-L-lisina em cada poço de uma placa de 384 poços e incube a placa em temperatura ambiente por 1 hora. Lave duas vezes com PBS e deixe secar por aproximadamente 30 minutos.
Adicione 30 microlitros de laminina a cada poço e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 2 horas. Repita as lavagens com PBS e prossiga com o revestimento das células. Adicione 20.000 neuroesferas unicelulares em 25 microlitros de meios de diferenciação a cada poço da placa de 384 poços e incube a placa a 37 graus Celsius por 5 dias.
Habilidades de pipetagem de alta precisão são necessárias para plaquear o número exato de neuroesferas que são desagregadas em células únicas. Portanto, recomenda-se diferenciar as neuroesferas em neurônios, antes do plaqueamento, para obter resultados mais reprodutíveis.
Após a incubação, adicione 5 microlitros de composto de teste a cada poço a 6 vezes a concentração desejada e incube as células por mais 24 horas.
Para realizar o ensaio de viabilidade celular, adicione 30 microlitros de reagente luminescente a cada poço e deixe a placa em um agitador por 2 minutos. Centrifugar a placa a 300 a 400 vezes g durante 30 segundos. Em seguida, incube a placa em temperatura ambiente por 10 minutos, protegendo-a da luz. Após a incubação, meça a luminescência em um leitor de microplacas.