Ensaio de complementação de luciferase dividida para identificar interações proteína-proteína específicas

As interações proteína-proteína são cruciais para as funções celulares vitais.

Para estudar as interações entre proteínas transmembranares - proteínas de membrana que abrangem a bicamada lipídica da membrana celular, comece com os poços de uma placa de vários poços contendo uma cultura de células de mamíferos aderentes.

Em seguida, adicione uma solução contendo um agente de transfecção adequado e um par de plasmídeos de expressão.

Um dos plasmídeos de expressão codifica uma proteína transmembrana de interesse fundida ao pequeno fragmento não funcional da enzima luciferase; o outro plasmídeo codifica uma segunda proteína transmembrana de interesse fundida ao grande fragmento não funcional da enzima luciferase.

Incube a placa. O agente de transfecção facilita a captação celular dos plasmídeos de expressão.

As células transfectadas com sucesso expressam as proteínas transmembranares. A interação entre as proteínas transmembranares expressas aproxima os fragmentos pequenos e grandes voltados para o citoplasma, fazendo com que eles se liguem e formem a enzima luciferase ativa.

Substitua o meio nos poços por meio sem soro para minimizar a luminescência de fundo. Adicione a solução de furimazina - um substrato de luciferase permeável a células. A furimazina entra nas células, após o que a luciferase oxida a furimazina, gerando luminescência de alta intensidade.

Usando um leitor de microplacas, meça a luminescência, o que sugere a forte interação entre as proteínas transmembrana.

Colha o aderente HEK293T cultura de células por tripsinização e ressuspenda as células em um meio de crescimento completo dedicado. Coloque as células em uma placa de fundo transparente, lado branco, de 96 poços. Ajustar o número total de alvéolos para acomodar todas as combinações e controlos testados, incluindo réplicas. Em seguida, cultive as células durante a noite em condições padrão.

No dia seguinte, transfecte as células com as combinações desejadas de plasmídeos de expressão. Dilua os plasmídeos em um meio livre de soro para 6,25 nanogramas por microlitro para cada construção e adicione o reagente de transfecção à base de lipídios em uma proporção apropriada de lipídio para DNA.

Incube os plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, adicione 8 microlitros da mistura lipídico-DNA aos poços designados. Misture o conteúdo da placa com rotação suave e cultive as células por 20 a 24 horas em condições padrão.

No dia seguinte, substitua o meio condicionado em cada poço por 100 microlitros de meio sem soro, certificando-se de que as células não se desprendam na troca do meio.

Imediatamente antes de medir a luminescência, misturar um volume de furimazina com 19 volumes de tampão de diluição. Adicione 25 microlitros da solução de trabalho de furimazina em cada poço e misture delicadamente a placa manualmente ou com um agitador orbital.

Insira a placa em um leitor de microplacas de luminescência e equilibre a placa a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Selecione os poços a serem analisados e leia a luminescência com um tempo de integração de 0,3 segundos. Continue monitorando a luminescência por até duas horas quando necessário.