Reação em cadeia da polimerase gradiente para determinar a temperatura ideal de recozimento

A reação em cadeia da polimerase gradiente é uma técnica para otimizar a temperatura de recozimento na qual os primers - DNA de fita simples específica da sequência - se ligam aos locais complementares no DNA molde.

Pegue uma mistura contendo primers diretos e reversos, dNTPs e DNA polimerase termoestável em um tampão apropriado. Adicione o DNA molde e transfira os constituintes para uma placa de PCR.

Coloque a placa em um termociclador gradiente com um bloco de aquecimento especializado. Isso estabelece um gradiente linear de temperatura de recozimento entre a faixa de 55 °C a 65 °C, com um incremento consistente na temperatura em toda a placa.

A reação aquece a placa a uma alta temperatura, desnaturando o DNA de fita dupla em fitas simples e ativando a DNA polimerase. Posteriormente, a temperatura é reduzida de acordo com os valores programados em cada poço, facilitando o recozimento do primer.

Na temperatura de recozimento abaixo do ideal, os primers se ligam não especificamente ao DNA desnaturado, levando a uma amplificação não específica durante a reação de PCR. Em temperatura acima do ideal, quantidades insuficientes dos primers se ligam ao DNA.

Na temperatura ideal, os prime