PCR de transcrição reversa quantitativa em tempo real para diagnóstico de infecções virais

A reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa em tempo real é útil para identificar infecções virais.

Comece com uma amostra contendo o RNA viral alvo. Adicione primers específicos para o alvo - auxiliando na síntese e amplificação do DNA - junto com a enzima transcriptase reversa e dNTPs.

Adicione a DNA polimerase termoestável - uma enzima para amplificar o DNA em ciclos de PCR - e o verde SYBR - um corante que se intercala em DNA de fita dupla, dsDNA. Coloque a reação em um termociclador. Defina uma temperatura apropriada para que os primers se liguem ao RNA alvo.

A transcriptase reversa adiciona dNTPs ao primer enquanto cliva simultaneamente o RNA molde, sintetizando o cDNA.

Aumente a temperatura, inativando a transcriptase reversa. Abaixe a temperatura, permitindo que os primers recozerem para o cDNA para amplificação subsequente. Aumente a temperatura para atingir a etapa de extensão, onde a DNA polimerase estende os primers, sintetizando o dsDNA.

Ciclos consecutivos resultam em amplificação exponencial do dsDNA. O verde SYBR se liga ao DNA em números crescentes, causando um aumento proporcional na emissão de fluorescência. Plote o sinal de fluorescência detectado ao longo dos ciclos.

Uma curva de amplificação positiva indica a presença de RNA viral na amostra.

Aumente a temperatura gradualmente para atingir a temperatura de fusão, desnaturando o dsDNA em fitas simples. As moléculas de corante ligadas são liberadas - perdendo sua fluorescência. Plote a fluorescência decrescente em relação à temperatura.

Um pico correspondente à temperatura de fusão específica do vírus confirma a infecção viral.

Planeje o layout de sua placa de PCR com uma planilha, levando em consideração as amostras de teste e controle. Prepare uma estação de trabalho de PCR desinfetando superfícies e, se estiver usando um gabinete UV, acenda a luz UV 10 minutos antes de começar.

Remova os reagentes e primers do freezer para descongelar, mas mantenha a mistura de enzimas no gelo o tempo todo. Misture os reagentes e centrifugue brevemente para coletar o líquido. Prepare misturas mestras de PCR para lissavírus e beta-actina, de acordo com as instruções do manuscrito. Deixe as master-mixes no gelo até a hora de usar. Misture e centrifugue as master-mixes preparadas e dispense 19 microlitros nos poços relevantes da placa ou tira de tubo compatível com a máquina de PCR.

Em uma sala separada ou em um gabinete UV, adicione cuidadosamente 1 microlitro do RNA preparado. Se estiver usando um gabinete UV, ligue a luz UV 10 minutos antes de iniciar. Após as amostras de teste, adicione o controle positivo e o controle sem modelo.

Ao adicionar o RNA às misturas principais, certifique-se de que ele seja adicionado ao poço correto. Use o plano de placa para ajudar nesta etapa.

Feche a placa, verificando se as tampas estão planas na placa, e gire-a para baixo para coletar todo o líquido no fundo dos poços. Certifique-se de que cada poço tenha o mesmo volume de líquido e que nenhuma bolha seja visível. Em seguida, transfira as amostras para a máquina de PCR.

Abra o programa, escolhendo 'SYBR Green' com 'Dissociação'. Selecione os poços a serem analisados, escolhendo "Desconhecido" como o tipo de amostra e "SYBR" como o corante fluorescente. Rotule os alvéolos no layout da placa com as informações da amostra, incluindo se o ensaio é para poço de Lyssavirus ou beta-actina.

Clique em "Configuração do Perfil Térmico" e modifique as condições de ciclo térmico conforme especificado no manuscrito. Clique em "Iniciar", escolha um local para salvar o arquivo e marque a caixa para desligar a lâmpada no final da execução. Quando a opção de iniciar antes do aquecimento da lâmpada aparecer, clique em "Executar agora", mas certifique-se de que a lâmpada tenha menos de 15 minutos para aquecer.