Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 4:08 min. • July 8th, 2025
A reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa em tempo real é útil para identificar infecções virais.
Comece com uma amostra contendo o RNA viral alvo. Adicione primers específicos para o alvo - auxiliando na síntese e amplificação do DNA - junto com a enzima transcriptase reversa e dNTPs.
Adicione a DNA polimerase termoestável - uma enzima para amplificar o DNA em ciclos de PCR - e o verde SYBR - um corante que se intercala em DNA de fita dupla, dsDNA. Coloque a reação em um termociclador. Defina uma temperatura apropriada para que os primers se liguem ao RNA alvo.
A transcriptase reversa adiciona dNTPs ao primer enquanto cliva simultaneamente o RNA molde, sintetizando o cDNA.
Aumente a temperatura, inativando a transcriptase reversa. Abaixe a temperatura, permitindo que os primers recozerem para o cDNA para amplificação subsequente. Aumente a temperatura para atingir a etapa de extensão, onde a DNA polimerase estende os primers, sintetizando o dsDNA.
Ciclos consecutivos resultam em amplificação exponencial do dsDNA. O verde SYBR se liga ao DNA em números crescentes, causando um aumento proporcional na emissão de fluorescência. Plote o sinal de fluorescênci
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