Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 3:02 min. • July 8th, 2025
A microesfera-PCR usa uma esfera de tamanho micro acoplada a oligonucleotídeos em sua superfície, o que permite a amplificação preferencial do DNA de fita simples.
Para iniciar a microesfera-PCR, pegue uma mistura de reação contendo fitas de DNA de fita simples molde, primers diretos com uma etiqueta de nucleotídeo adicional, DNA polimerase termoestável, dNTPs e microesferas exibindo sondas de oligonucleotídeos de fita simples.
Coloque o tubo em um termociclador e funcione nas condições definidas.
No primeiro ciclo, na temperatura de recozimento, o DNA molde se liga à sonda na superfície da microesfera, de modo que o DNA molde funcione como a fita sensorial. Durante a extensão, a polimerase estende o DNA e o duplex permanece ligado à microesfera.
No ciclo seguinte, durante a desnaturação, o DNA molde se separa da microesfera, deixando a fita da sonda ligada à superfície - servindo como modelo para uma nova fita.
Durante o recozimento, o primer marcado se liga à fita antisense. Mais tarde, a polimerase o estende para sintetizar a fita sensorial com a etiqueta de nucleotídeos.
Repita o ciclo várias vezes para gerar várias cópias do DNA de fita simples sensorial, que vão para a solução, enquanto os contaminantes de fita dupla permanecem presos.
Transfira os produtos de PCR para um tubo contendo um tampão de carga. Carregue o produto e os marcadores em diferentes poços do gel e separe usando eletroforese em gel de agarose.
Os DNAs molde formam uma banda fraca de baixo peso molecular, enquanto uma banda intensa de alto peso molecular confirma a amplificação do DNA de fita simples.
Obtenha aproximadamente 25 microesferas por meio de contagem microscópica usando um microscópio óptico com ampliação de 40X. Em seguida, combine todos os reagentes conforme descrito no protocolo de texto. Coloque as amostras em um termociclador e inicie a PCR assimétrica nas condições apropriadas.
A coleta de sobrenadante após uma PCR simétrica é uma das etapas mais críticas, pois é um processo importante para a geração de DNA de fita simples com microesferas.
Após a amplificação, adicione oito microlitros de tampão de carga 6X a cada amostra. Carregue 15 microlitros de cada amostra em gel de agarose a 2%. Em seguida, realize eletroforese a 100 volts por 35 minutos em tampão TAE 1X.