Por que a microesfera-PCR melhora a validação do alvo?

A Microesfera-PCR gera DNA de fita simples puro ao separar as fitas sentido amplificadas de contaminantes de dupla fita, reduzindo sinais falsos em ensaios baseados em hibridização utilizados em estudos de interação com alvos.

Como a amplificação assimétrica na PCR com microesferas auxilia na identificação de leads?

O método utiliza iniciadores marcados para sintetizar preferencialmente as fitas sentido, permitindo a produção de DNA de fita simples livre de contaminantes, o que melhora a confiabilidade do ensaio durante a triagem de compostos líderes.

Quais medições quantitativas a microesfera-PCR permite para avaliação pré-clínica?

A PCR com microesferas produz amplicons de DNA de fita simples quantificáveis, adequados para quantificação por eletroforese em gel, permitindo a medição consistente de alterações na expressão gênica em modelos de doenças.

Por que os requisitos de replicação são importantes para a PCR com microesferas em colaborações multifuncionais?

A coleta reprodutível do sobrenadante após a amplificação garante um rendimento consistente de DNA de fita simples, permitindo o compartilhamento confiável de dados entre equipes de descoberta, desenvolvimento de ensaios e pré-clínicas.

Qual análise estatística é necessária antes de implementar a microesfera-PCR em um pipeline de descoberta?

A implementação exige a validação da eficiência de amplificação e pureza do produto por meio de experimentos replicados, com comparação estatística de bandas de DNA de fita simples versus fita dupla para confirmar a especificidade.

Reação em cadeia da polimerase da microesfera para amplificar o DNA de fita simples

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

0 vistas • 3:02 min • July 8th, 2025

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A microesfera-PCR usa uma esfera de tamanho micro acoplada a oligonucleotídeos em sua superfície, o que permite a amplificação preferencial do DNA de fita simples.

Para iniciar a microesfera-PCR, pegue uma mistura de reação contendo fitas de DNA de fita simples molde, primers diretos com uma etiqueta de nucleotídeo adicional, DNA polimerase termoestável, dNTPs e microesferas exibindo sondas de oligonucleotídeos de fita simples.

Coloque o tubo em um termociclador e funcione nas condições definidas.

No primeiro ciclo, na temperatura de recozimento, o DNA molde se liga à sonda na superfície da microesfera, de modo que o DNA molde funcione como a fita sensorial. Durante a extensão, a polimerase estende o DNA e o duplex permanece ligado à microesfera.

No ciclo seguinte, durante a desnaturação, o DNA molde se separa da microesfera, deixando a fita da sonda ligada à superfície - servindo como modelo para uma nova fita.

Durante o recozimento, o primer marcado se liga à fita antisense. Mais tarde, a polimerase o estende para sintetizar a fita sensorial com a etiqueta de nucleotídeos.

Repita o ciclo várias vezes para gerar várias cópias do DNA de fita simples sensorial, que vão para a solução, enquanto os contaminantes de fita dupla permanecem presos.

Transfira os produtos de PCR para um tubo contendo um tampão de carga. Carregue o produto e os marcadores em diferentes poços do gel e separe usando eletroforese em gel de agarose.

Os DNAs molde formam uma banda fraca de baixo peso molecular, enquanto uma banda intensa de alto peso molecular confirma a amplificação do DNA de fita simples.

Obtenha aproximadamente 25 microesferas por meio de contagem microscópica usando um microscópio óptico com ampliação de 40X. Em seguida, combine todos os reagentes conforme descrito no protocolo de texto. Coloque as amostras em um termociclador e inicie a PCR assimétrica nas condições apropriadas.

A coleta de sobrenadante após uma PCR simétrica é uma das etapas mais críticas, pois é um processo importante para a geração de DNA de fita simples com microesferas.

Após a amplificação, adicione oito microlitros de tampão de carga 6X a cada amostra. Carregue 15 microlitros de cada amostra em gel de agarose a 2%. Em seguida, realize eletroforese a 100 volts por 35 minutos em tampão TAE 1X.