Nested-PCR para detectar uma sequência genômica viral específica

A reação em cadeia da polimerase aninhada, PCR aninhada, pode amplificar seletivamente sequências de genes específicos.

Para detectar uma sequência viral alvo, comece com uma mistura mestre contendo primers externos complementares a uma região de DNA maior contendo a sequência viral alvo, dNTPs e DNA polimerase termoestável em um tampão apropriado.

Adicione DNA viral de fita dupla, extraído das células infectadas pelo vírus, a essa mistura. Transfira o tubo para um termociclador; execute o primeiro ciclo de PCR.

Durante a desnaturação, o DNA de fita dupla produz dois modelos de fita simples. A uma temperatura de recozimento apropriada, os primers externos se ligam às sequências-alvo correspondentes. Posteriormente, a DNA polimerase estende os primers usando dNTPs, produzindo grandes amplicons, contendo a sequência específica dentro do DNA amplificado.

Transfira esses amplicons para um novo tubo. Complemente com uma mistura master fresca contendo primers internos ou aninhados visando uma sequência menor e mais específica dentro do DNA amplificado maior. Execute o segundo PCR.

Durante a segunda PCR, a fita de DNA se desnatura. Após a desnaturação, os primers aninhados se ligam aos lo