Por que a PCR aninhada melhora a especificidade na validação do alvo viral?

A PCR aninhada utiliza dois conjuntos sequenciais de iniciadores para reduzir a amplificação inespecífica, aumentando a confiança na presença do alvo durante as fases iniciais de descoberta.

Como o isolamento da variável independente contribui para o desenvolvimento de ensaios na PCR aninhada?

Isolar variáveis como concentração do iniciador e temperatura de pareamento garante amplificação reprodutível, essencial para a padronização do ensaio.

Quais medições quantitativas a PCR aninhada permite para avaliação pré-clínica?

A PCR aninhada produz níveis mensuráveis de amplicons que permitem a quantificação da carga viral, apoiando avaliações de resposta à dose e eficácia.

Por que os requisitos de replicação são importantes para a colaboração multifuncional na PCR aninhada?

A replicação entre execuções e locais garante resultados consistentes, permitindo o compartilhamento confiável de dados entre equipes de descoberta, triagem e pré-clínicas.

Quais são as capacidades de análise estatística necessárias antes de implementar a PCR aninhada em fluxos de trabalho de triagem?

A variabilidade da linha de base e os limiares de sinal-ruído devem ser estabelecidos para distinguir amplificação real do ruído de fundo, garantindo a robustez do ensaio.

Nested-PCR para detectar uma sequência genômica viral específica

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

0 vistas • 3:20 min • July 8th, 2025

A reação em cadeia da polimerase aninhada, PCR aninhada, pode amplificar seletivamente sequências de genes específicos.

Para detectar uma sequência viral alvo, comece com uma mistura mestre contendo primers externos complementares a uma região de DNA maior contendo a sequência viral alvo, dNTPs e DNA polimerase termoestável em um tampão apropriado.

Adicione DNA viral de fita dupla, extraído das células infectadas pelo vírus, a essa mistura. Transfira o tubo para um termociclador; execute o primeiro ciclo de PCR.

Durante a desnaturação, o DNA de fita dupla produz dois modelos de fita simples. A uma temperatura de recozimento apropriada, os primers externos se ligam às sequências-alvo correspondentes. Posteriormente, a DNA polimerase estende os primers usando dNTPs, produzindo grandes amplicons, contendo a sequência específica dentro do DNA amplificado.

Transfira esses amplicons para um novo tubo. Complemente com uma mistura master fresca contendo primers internos ou aninhados visando uma sequência menor e mais específica dentro do DNA amplificado maior. Execute o segundo PCR.

Durante a segunda PCR, a fita de DNA se desnatura. Após a desnaturação, os primers aninhados se ligam aos locais-alvo no molde de fita simples, seguido pela extensão do primer mediada pela polimerase.

Repita o segundo ciclo de PCR várias vezes para amplificar exclusivamente a sequência viral alvo.

Analise o produto da PCR para visualizar os amplicons menores, confirmando a presença da sequência viral específica.

Recupere os reagentes necessários e mantenha-os no gelo em uma sala limpa até que estejam prontos para uso. Quando estiver pronto, descongele e vortex os reagentes. Em seguida, prepare 48 microlitros de mistura de PCR de primeira rodada para cada amostra em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito na Tabela 2 do protocolo de texto, e divida a mistura de reação em tubos de PCR de 0,2 mililitro.

Em uma estação de trabalho de PCR em uma sala de modelos, adicione uma amostra de 2 microlitros do cDNA à mistura de PCR da primeira rodada. Inclua dois microlitros de cDNA CVS-11 como controle positivo e dois microlitros de água bidestilada como controle negativo. Em seguida, transfira os tubos selados para um termociclador PCR e cicle usando os parâmetros listados na Tabela 3 do protocolo de texto.

Para começar, prepare 48 microlitros de mistura de PCR de segunda rodada para cada amostra em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito na Tabela 4 do protocolo de texto, e divida a mistura de reação em tubos de PCR de 0,2 mililitro. Adicione dois microlitros do produto de PCR de primeira rodada à mistura de PCR de segunda rodada. Incluir água bidestilada como controlo negativo para esta ronda de PCR. Em seguida, execute o ciclo térmico de PCR usando os parâmetros listados na Tabela 3 do protocolo de texto.