Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 4:09 min. • July 8th, 2025
A reação em cadeia da polimerase de fusão de alta resolução, HRM-PCR, detecta DNA de fita dupla, variações de sequência de dsDNA com alta precisão.
Comece com uma mistura principal contendo Taq polimerase inativa, trifosfatos de desoxirribonucleotídeo - dNTPs - e o corante repórter fluorescente. Adicione os primers para frente e para trás. Pipetar a mistura para os poços de uma placa de PCR.
Adicione o modelo dsDNA. Sele a placa, evitando a evaporação da mistura. Inicie o PCR.
A alta temperatura de desnaturação desnatura o dsDNA em DNA de fita simples, ssDNA, e ativa a polimerase. A reação é então resfriada até a temperatura de recozimento, facilitando a ligação direta e reversa do primer aos ssDNAs por meio do emparelhamento de bases complementares específico do local.
A polimerase ativada é recrutada, estendendo o duplex DNA-primer por adição de dNTP.
O corante repórter fluorescente - um corante específico do dsDNA presente em concentrações de saturação - intercala dentro de todo o duplex, fluorescendo intensamente. O duplex passa por vários ciclos de PCR, produzindo vários fragmentos contendo variantes.
Pós-PCR, realize a análise da curva de fusão aumentando novamente a temperat
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