Reação em cadeia da polimerase de gotículas multiplex para detectar metilação do DNA em leucócitos

A metilação do resíduo de citosina do DNA é uma característica dos leucócitos ou glóbulos brancos.

A

reação em cadeia da polimerase de gotículas multiplex, ou mdPCR, permite a identificação simultânea de várias regiões de DNA metilado dentro dos leucócitos.

Prepare uma mistura contendo tampão de reação, DNA polimerase e água livre de nuclease. Adicione primers diretos e reversos e sondas de hidrólise fluorescente específicas para cada região-alvo. As sondas compreendem repórteres de fluoróforos de cores diferentes ligados a atenuadores para inibir a emissão de fluorescência.

Adicione DNA convertido em bissulfito, em que as citosinas não metiladas são desaminadas em uracilas enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. Misturar.

Encha uma seringa de vidro com uma mistura de óleo transportador-surfactante e outra com uma mistura de óleo-PCR transportador e conecte-as ao gerador de gotículas microfluídicas. A mistura de PCR aquosa de óleo transportador emulsifica em gotículas do tamanho de subnanolitros. O surfactante estabiliza a emulsão e evita a fusão de gotículas.

Colete as gotículas e execute a PCR. Dentro de cada gotícula, a alta temperatura de desnaturação desnatura