Reação em cadeia da polimerase de gotículas multiplex para detectar metilação do DNA em leucócitos

A metilação do resíduo de citosina do DNA é uma característica dos leucócitos ou glóbulos brancos.

A

reação em cadeia da polimerase de gotículas multiplex, ou mdPCR, permite a identificação simultânea de várias regiões de DNA metilado dentro dos leucócitos.

Prepare uma mistura contendo tampão de reação, DNA polimerase e água livre de nuclease. Adicione primers diretos e reversos e sondas de hidrólise fluorescente específicas para cada região-alvo. As sondas compreendem repórteres de fluoróforos de cores diferentes ligados a atenuadores para inibir a emissão de fluorescência.

Adicione DNA convertido em bissulfito, em que as citosinas não metiladas são desaminadas em uracilas enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. Misturar.

Encha uma seringa de vidro com uma mistura de óleo transportador-surfactante e outra com uma mistura de óleo-PCR transportador e conecte-as ao gerador de gotículas microfluídicas. A mistura de PCR aquosa de óleo transportador emulsifica em gotículas do tamanho de subnanolitros. O surfactante estabiliza a emulsão e evita a fusão de gotículas.

Colete as gotículas e execute a PCR. Dentro de cada gotícula, a alta temperatura de desnaturação desnatura o DNA de fita dupla em DNA de fita simples e ativa a polimerase. A temperatura de reação é reduzida, permitindo o recozimento específico do local dos primers e sondas.

À medida que a polimerase se liga e estende o duplex DNA-primer, os uracilos amplificam como timinas, enquanto as citosinas metiladas amplificam como citosinas, permitindo a distinção de regiões metiladas e não metiladas. A polimerase cliva ainda mais e libera o repórter da sonda, causando emissão de fluorescência.

Pós-PCR, visualize as gotas ao microscópio. A cor de fluorescência indica a presença de alvos específicos de DNA metilado.

Para a geração de gotículas, misture 1 microlitro de DNA convertido em bissulfito com mistura mestre de sonda recém-preparada em um tubo de PCR e colete a amostra com uma breve centrifugação. Use conexões PEEK para conectar tubos fluídicos descartáveis a duas seringas de vidro de precisão com volume de 250 microlitros e pré-encha uma seringa de vidro de precisão com 250 microlitros de óleo transportador contendo 5% de fluoro-surfactante e uma seringa de vidro de precisão com 50 microlitros de óleo transportador.

Quando ambas as seringas estiverem carregadas, carregue 100 microlitros da mistura de PCR na seringa de óleo transportador e coloque um dispositivo microfluídico de gotículas no palco de um microscópio de luz vertical equipado com uma câmera de alta velocidade.

Para a observação e registro da formação de gotículas em tempo real, coloque as seringas pré-cheias em uma bomba de seringa programável e use a união PEEK com conexões para conectar a tubulação das seringas à tubulação dos respectivos canais de entrada do dispositivo microfluídico de gotículas.

Coloque a tubulação da saída do gerador de gotículas para o interior de um tubo de PCR de 0.5 mililitro e ajuste a taxa de fluxo da bomba de seringa para 2 microlitros por minuto. Deixe o tamanho da gota se estabilizar antes de coletar a emulsão resultante. Colete lenta e cuidadosamente a emulsão da parte superior do tubo e transfira 75 microlitros da solução para um tubo de PCR de 200 microlitros para ciclagem térmica.

Em seguida, confirme se o teor de óleo no tubo de PCR corresponde ao volume da fase dispersa para evitar a coalescência das gotículas durante o ciclo térmico e coloque o tubo de 200 microlitros no termociclador.