Dot Blot quantitativo para estimar proteínas-alvo em um lisado tecidual

O dot blot quantitativo - ou QDB - é uma técnica útil para quantificar a concentração de proteínas-alvo em uma amostra. Uma vez que a amostra é imobilizada em uma membrana polimérica, as proteínas podem ser detectadas por immunoblotting.

Para começar, pegue uma placa QDB - uma placa de vários poços com uma membrana de nitrocelulose presa ao fundo de cada poço. Adicione a amostra - um lisado de tecido contendo a proteína alvo - no centro da membrana dentro do poço.

Deixe a amostra secar. A proteína alvo se liga à membrana por meio de interações não covalentes.

Adicione uma solução de bloqueio. As proteínas da solução se ligam aos locais não ligados na membrana, impedindo a ligação não específica de reagentes de detecção.

Em seguida, adicione uma solução contendo anticorpos primários que se ligam à proteína alvo na amostra. Lave para remover anticorpos não ligados.

Em seguida, adicione uma solução secundária de anticorpos. Essas moléculas - marcadas com uma enzima peroxidase - se ligam aos anticorpos primários ligados às proteínas. Lave para remover anticorpos não ligados.

Por fim, adicione uma solução contendo um substrato quimioluminescente e peróxido de hidrogênio. Utilizando peróxido de hidrogênio, a peroxidase ligada ao anticorpo oxida o substrato e emite luz. Usando um leitor de placas, meça a intensidade de luminescência da amostra.

Gerar uma curva de luminescência padrão usando uma diluição em série com concentrações conhecidas da proteína alvo. Representar graficamente o valor de luminescência medido da amostra na curva para determinar a concentração da proteína alvo.

Neste procedimento, coloque uma caixa de ponteira de pipeta vazia sob a placa QDB para evitar que a parte inferior da placa toque na superfície da mesa. Carregue até 2 microlitros da amostra no centro da membrana na parte inferior de uma unidade individual da placa QDB.

Nunca permita que a parte inferior da placa QDB toque em qualquer superfície, durante o carregamento, e não carregue muito para o poço individual. Você não experimenta mais de 4 microlitros por poço.

Em seguida, deixe a placa QDB carregada por uma hora em temperatura ambiente ou deixe a placa carregada a 37 graus Celsius por quinze minutos em um espaço bem ventilado. Para bloquear a placa, mergulhe a placa QDB no tampão de transferência e agite-a suavemente por 10 segundos.

Depois disso, enxágue a placa QDB suavemente com TBST três vezes e, em seguida, lave a placa por cinco minutos em TBST sob agitação constante. Em seguida, bloqueie a placa QDB com tampão de bloqueio por uma hora sob agitação constante. Agora, dilua o anticorpo primário no tampão de bloqueio em uma concentração escolhida e adicione 100 microlitros dele a cada poço individual de uma placa comum de 96 poços.

Insira a placa QDB na placa de 96 poços e incube as placas combinadas por duas horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 graus Celsius sob agitação constante. Depois disso, enxágue a placa suavemente com TBST três vezes, antes de ser lavada com TBST três vezes - cada vez por cinco minutos sob agitação constante.

Em seguida, dilua o anticorpo secundário no tampão de bloqueio na concentração escolhida e alíquota de 100 microlitros em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, incube a placa QDB dentro da placa carregada de 96 poços por uma hora em temperatura ambiente sob agitação constante. Enxágue a placa QDB suavemente três vezes com TBST e, em seguida, lave a placa três vezes, cinco minutos cada com TBST sob agitação constante.

Para quantificação, prepare o substrato ECL e a alíquota em uma placa de 96 poços a 100 microlitros por poço. Em seguida, insira a placa QDB dentro da placa de 96 poços por dois minutos sob agitação constante. Depois disso, remova a placa QDB da placa de 96 poços e agite brevemente para remover o excesso de líquido. Em seguida, coloque a placa em uma placa de microtitulação branca. Em seguida, ligue o leitor de microplacas e selecione a placa com tampa na interface do usuário, antes de colocar as placas combinadas dentro do leitor de microplacas para quantificação.