Western blotting quantitativo para estimar os níveis de expressão de proteínas

O western blotting quantitativo - uma técnica baseada na normalização total de proteínas - é útil para quantificar os níveis de expressão da proteína-alvo.

Para começar, carregue o lisado de tecido nos poços de um gel gradiente de poliacrilamida. O lisado contém a proteína alvo, juntamente com outras proteínas celulares.

Execute o gel em uma tensão apropriada para a separação eletroforética das proteínas da amostra ao longo do gradiente. Após a conclusão, coloque o gel em cima da membrana polimérica de uma pilha de transferência.

Aplique uma corrente elétrica para transferir as proteínas separadas para a membrana. Em seguida, coloque a membrana em uma coloração fluorescente de proteína total. As moléculas de corante carregadas na mancha se ligam eletrostaticamente a todas as proteínas da membrana.

Adicione uma solução de bloqueio. As proteínas da solução se ligam à membrana, assim. impedindo a ligação não específica dos reagentes de detecção. Adicione um anticorpo primário ligando-se apenas à proteína alvo. Em seguida, adicione um anticorpo secundário - marcado com um fluoróforo - que se liga ao anticorpo primário.

Excite a amostra com um laser. Registre a fluorescência emitida pelas moléculas de corante da coloração total da proteína e dos fluoróforos ligados a anticorpos em seus comprimentos de onda correspondentes.

Para calcular o valor de carga de proteína normalizado, divida o sinal de proteína total de cada pista pelo valor mais alto. Divida o sinal da proteína alvo pelo valor de carga normalizado correspondente para determinar a expressão relativa da proteína alvo.

Para eletroforese, instale um gel de gradiente Bis-Tris pré-moldado de 4 a 12% no sistema de câmara de eletroforese em gel e carregue 3,5 microlitros de um padrão de proteína no poço. Ao usar um padrão interno para normalização entre membranas, carregue uma quantidade igual às outras amostras nos três primeiros poços próximos à escada de proteínas e carregue 30 microgramas de cada amostra nos poços restantes. Em seguida, passe as amostras pelo gel de empilhamento a 80 volts por 10 minutos, seguido de 150 volts por mais 45 a 60 minutos.

No final da eletroforese, para montar a pilha de transferência, coloque o gel de proteína na pilha inferior contendo a membrana de difluoreto de polivinilideno seguida do papel de filtro. Use o rolo absorvente para remover quaisquer bolhas de ar e coloque a pilha superior na parte superior do papel de filtro, antes de rolar a pilha novamente para remover as bolhas de ar.

Transfira toda a pilha para o dispositivo de transferência com o eletrodo no lado esquerdo do dispositivo e coloque a esponja de gel em cima da pilha, de modo que a esponja fique alinhada com os contatos elétricos correspondentes no dispositivo.

Depois de fechar a tampa, selecione e inicie o programa apropriado. No final do programa, corte a membrana no tamanho do gel e lave a membrana cortada rapidamente com água bidestilada antes de continuar com a coloração total da proteína.

Para coloração de proteína total, enrole a membrana em um tubo de 50 mililitros com o lado da proteína voltado para dentro e rotule a membrana com 5 mililitros de solução de coloração de proteína em um rolo por 5 minutos em temperatura ambiente em uma capela de exaustão.

No final da incubação, lave a membrana rapidamente com 5 mililitros de solução de lavagem, retornando o tubo brevemente ao rolo entre as lavagens, seguido de um breve enxágue com água ultrapura. Adicione 3 milímetros de tampão de bloqueio à membrana e retorne a membrana ao rolo por 30 minutos em temperatura ambiente. Substitua o tampão de bloqueio pelo anticorpo primário de interesse na concentração otimizada apropriada e incube a membrana no rolo durante a noite a 4 graus Celsius.

No dia seguinte, lave a membrana 6 vezes por 5 minutos com 5 mililitros de PBS fresco por lavagem no rolo em temperatura ambiente. Após a última lavagem, incubar a membrana com a solução de anticorpos secundários apropriada no rolo durante 1 hora à temperatura ambiente, seguida de 3 lavagens durante 30 minutos por lavagem. Após a última lavagem, seque a membrana e use papel alumínio para mantê-la protegida da luz.

Para aquisição de imagem, coloque a membrana no scanner com o lado da proteína voltado para baixo e selecione a área de digitalização no software. Em seguida, adquira imagens em ambos os canais e exporte as imagens para um programa de análise de imagem apropriado.

Exiba o canal de 700 nanômetros para mostrar o resultado total da coloração da proteína e selecione "Análise" e desenhe um retângulo para definir a área de interesse para normalização. Em seguida, copie e cole a primeira área do retângulo em cada amostra individual para garantir que a região definida tenha o mesmo tamanho para todas as pistas analisadas.

Para quantificar a concentração de proteína em cada pista, copie os resultados da coloração de proteína total e da proteína de interesse para um programa de planilha e determine o sinal de coloração de proteína total mais alto. Em seguida, divida cada valor total do sinal de coloração de proteína por esse valor para obter o valor de carga de proteína normalizado e divida o valor do sinal de 800 nanômetros de cada amostra individual por seu valor de proteína normalizado correspondente para calcular a proporção relativa de expressão de proteína em diferentes amostras.