Western Blotting de célula única para determinar a heterogeneidade celular

Os locais de inflamação contêm várias células imunológicas, incluindo monócitos, macrófagos e leucócitos.

Para identificar uma população de células heterogêneas por western blotting unicelular, pegue um chip de blotting pré-hidratado, consistindo em um gel de poliacrilamida fotoativável padronizado em blocos. Cada bloco possui vários micropoços. A padronização em vários blocos captura várias células em paralelo.

Adicionar uma suspensão contendo uma população celular heterogénea. As dimensões do poço permitem que células individuais se assentem. Mergulhe o chip em uma câmara de eletroforese cheia de um tampão apropriado. As moléculas de detergente no tampão rompem a membrana da célula, liberando conteúdo celular.

Aplique um campo elétrico. As proteínas liberadas migram através do gel, separando-se em bandas de tamanhos distintos. Lave o chip com um tampão de lavagem para remover moléculas não especificamente ligadas, deixando apenas proteínas celulares, incluindo as proteínas marcadoras desejadas.

Exponha o gel à luz UV, ativando sua superfície e imobilizando as proteínas.

Adicione um coquetel de anticorpos primários que se ligam especificamente a proteínas marcadoras distintas de cada tipo de célula, formando complexos de anticorpos primários proteínas. Dispense uma mistura de anticorpos secundários marcados com fluorescência, que se ligam aos seus respectivos anticorpos primários, marcando a proteína marcadora específica da célula correspondente.

Coloque o chip em um scanner. Medir a intensidade de fluorescência que é proporcional ao nível de expressão do marcador proteico correspondente específico para uma única célula da suspensão de células da amostra.

Para uma análise de Western blot de célula única, adicione 1 mililitro de suspensão de célula única diluída a um chip de Western blot de célula única reidratado no fundo de uma placa de Petri de 10 centímetros. Após cinco a quinze minutos, examine o chip sob microscopia de campo claro. Aproximadamente 15% a 20% dos micropoços devem ser ocupados por uma única célula, e menos de 2% dos poços devem conter duas ou mais células.

Se o chip tiver sido carregado corretamente, incline o prato 45 graus e lave o chip três vezes com buffer de suspensão para remover quaisquer células não capturadas. Após a última lavagem, carregue cuidadosamente o chip na célula de eletroforese de um instrumento ocidental de célula única com o lado do gel para cima e cubra todo o chip Western blot de célula única com lise / tampão de execução. Inicie a lise celular e execute o instrumento de acordo com os parâmetros de experimento apropriados.

No final da corrida, enxágue o chip com duas lavagens de 10 minutos com tampão de lavagem fresco por lavagem em temperatura ambiente. Após a segunda lavagem, adicione 80 microlitros da solução primária de anticorpos de interesse à câmara de sondagem de anticorpos e abaixe o chip com o lado do gel para baixo para que a solução de anticorpos seja absorvida pelo chip.

Após duas horas em temperatura ambiente, lave o cavaco três vezes em tampão de lavagem e uma vez em água em uma coqueteleira. Incubar o chip com um anticorpo secundário adequado durante uma hora à temperatura ambiente, protegido da luz. No final da incubação, lave o cavaco três vezes com tampão de lavagem e gire o cavaco em um girador de lâmina para remover qualquer tampão de lavagem restante.

Para remover o chip Western blot de célula única, coloque um rack de tubo de 50 mililitros em um banho-maria de 60 graus Celsius com a água apenas 1 centímetro acima do rack. Em uma capela de exaustão, adicione 40 mililitros de tampão de decapagem e 320 microlitros de beta-mercaptoetanol a um recipiente. Coloque o chip em uma placa de Petri de 10 centímetros dentro da lata e sele a lata com parafilme.

Em seguida, coloque o recipiente dentro do suporte para tubos no banho-maria. Após 90 minutos, transfira cuidadosamente o chip para uma nova placa de Petri e lave brevemente o chip uma vez com tampão de lavagem antes de adicionar 15 mililitros de tampão de lavagem fresco à placa de Petri para uma lavagem de 15 minutos no shaker.