Northern blot para detectar e quantificar microRNA específico no extrato total de RNA do tecido vegetal

MicroRNAs, miRNAs, são RNAs pequenos, de fita simples e não codificantes. Os miRNAs se incorporam a um complexo multiproteico e se ligam a sequências de mRNA alvo complementares para regular negativamente a expressão gênica.

Para detectar miRNA específico do RNA total dos tecidos vegetais, adicione um corante de carregamento de gel contendo corantes de rastreamento e formamida - um agente desnaturante de RNA. Aqueça a amostra para desnaturar o RNA e evitar a formação de estrutura secundária antes da eletroforese.

Carregue a amostra e os marcadores de RNA padrão em poços de um gel de poliacrilamida desnaturante pré-montado. Execute a eletroforese, facilitando a separação baseada no tamanho dos fragmentos de RNA.

Transfira o gel para papéis de filtro pré-úmidos em um de eletroborrão. Alinhe uma membrana de nylon embebida em tampão sobre o gel. Em seguida, empilhe os papéis de filtro pré-úmidos. Realize eletroblotting.

A corrente elétrica faz com que o RNA carregado negativamente, incluindo o miRNA, saia do gel para a superfície da membrana de náilon carregada positivamente. Exponha a membrana à luz ultravioleta; isso reticula os RNAs à membrana, evitando assim a perda de RNA.

Incube a membrana em tampão de hibridização contendo agentes bloqueadores que ocupam os locais de ligação não específicos para reduzir o ruído de fundo.

Adicione uma sonda de oligonucleotídeo de RNA radiomarcada complementar ao miRNA alvo para se ligar especificamente a ele. Lave a membrana com tampão, removendo as sondas não ligadas.

Use um sistema de imagem de fósforo para detectar e quantificar as intensidades do sinal de hibridização radioativa. O sinal de alta resolução indica a expressão específica de miRNA no tecido vegetal.

Pare a pré-corrida do gel.

Lave bem os poços antes de carregar a amostra para remover os depósitos de ureia dentro dos poços. Aqueça as amostras de RNA ressuspensas a 98 graus por 1 minuto. Carregue as amostras quentes nos poços usando pontas capilares. Evite introduzir bolhas de ar.

Carregamento completo de todas as amostras e monte a tampa. Execute o gel a 80 volts por 3 horas ou até que o azul de bromofenol escorra completamente. Use membrana de náilon carregada positivamente para a transferência. Corte-o nas dimensões da placa de vidro. Rotule a membrana no canto superior direito. Coloque suavemente a membrana na superfície da água Milli-Q estéril. Certifique-se de colocar o lado da etiqueta voltado para baixo, voltado para a superfície da água.

Pegue uma bandeja limpa e prepare o sanduíche de gel para eletrotransferência. Coloque o lado cinza do para baixo. Despeje 1X TBE ligeiramente acima do nível do. Molhe previamente a almofada de fibra em 1X TBE e aperte-a para remover as bolhas de ar. Corte dois pedaços de papel mata-borrão do tamanho de uma almofada de fibra.

Molhe previamente um pedaço de papel mata-borrão em 1X TBE e coloque-o sobre a almofada de fibra. Remova as bolhas de ar rolando uma pipeta de plástico sobre o papel. Umedeça novamente outro pedaço de papel mata-borrão em um TBE 1X e coloque-o sobre o. Rollover para remover bolhas de ar. Agora a configuração do sanduíche está pronta para eletrotransferência.

Após a conclusão da eletroforese, pare a corrida e remova a tampa do aparelho. Remova o em execução da configuração. Retire as placas de vidro do em execução.

Remova cuidadosamente o gel do conjunto. Coloque-o sobre o mata-borrão de forma que a primeira amostra de RNA carregada fique à sua direita. Mergulhe suavemente a membrana pré-embebida em 1X TBE e coloque-a sobre o gel voltado para o lado da etiqueta voltado para baixo. Não deixe a membrana e o gel secarem. Role suavemente para remover as bolhas de ar.

Mergulhe um pedaço de papel mata-borrão em 1X TBE e coloque-o sobre a membrana. Remova as bolhas de ar. Coloque outro pedaço de papel mata-borrão e remova as bolhas de ar. Complete o sanduíche colocando a almofada de fibra sobre o conjunto. Feche o com firmeza.

Coloque o transblot no módulo. Encha o tanque com 1X TBE, pH 8,2, até a marca de mancha. Feche a tampa do aparelho e transfira a 10 volts durante a noite a 4 graus ou em uma câmara fria. Mantenha o reticulador UV pronto e ajuste-o para 1,200 pouco antes da conclusão da eletrotransferência.

Após a conclusão da transferência, remova o do módulo. Coloque a membrana úmida em uma folha A4 colocando o lado marcado para cima. Reticule o RNA à membrana por irradiação com luz UV de 254 nanômetros a 120 milijoules. O blot reticulado pode ser armazenado a 4 graus ou usado para hibridização.

Projete uma sonda que seja completamente complementar ao pequeno RNA que deve ser detectado e rotule a sonda em sua extremidade 5 principais usando a enzima PNK e combine os componentes conforme mostrado. Incube a mistura de reação a 37 graus por 30 minutos.

Após 30 minutos de incubação, use colunas G-25 para separar as sondas não rotuladas da mistura de reação. Para melhorar a rotulagem da sonda, prepare a coluna G-25 antes de usar. Coloque o borrão, com o lado do RNA voltado para cima, dentro de um frasco de hibridização. Misture vigorosamente o tampão de hibridização antes de usar. Adicione 10 ml de tampão de hibridização e coloque o frasco de hibridização dentro de um forno de hibridização mantido a 35 graus com rotação.

Realize a pré-hibridização por 20 a 30 minutos. Após a pré-hibridização, retire a garrafa do forno. Adicione a sonda rotulada no buffer de hibridização suavemente. Certifique-se de que não sejam criadas bolhas de ar. Incube a mancha dentro do forno a 35 graus com rotação por 12 horas.

Após a hibridização, remova o tampão de hibridização da garrafa. Faça uma lavagem rápida das manchas usando o tampão de lavagem I. Esta etapa é realizada para remover o excesso de solução de hibridização dos borrões. Além disso, incube as manchas a 35 graus por 30 minutos usando o tampão de lavagem I. Execute outra lavagem usando o tampão II a 35 graus por 30 minutos.

Depois de lavar a mancha, coloque-a dentro de uma tampa de hibridização, remova o excesso de tampão e feche-a. Coloque-o dentro de um e exponha-o a uma tela de imagem de fósforo livre de radiação por 12 horas. Detecte o sinal de hibridização usando o Typhoon Biomolecular Imager e analise os resultados usando o software ImageJ.