Biossensor de efeito de campo baseado em biossensor de grafeno para detectar interações proteína-proteína

As interações proteína-proteína, IBPs, são críticas na regulação da maioria dos processos biológicos.

Para detectar PPIs usando biossensor de efeito de campo, comece com um chip de transistor de efeito de campo de grafeno. O chip compreende uma superfície de grafeno funcionalizada com carboxila como o canal semicondutor entre a fonte e os eletrodos de drenagem.

Incubar o chip com uma nova solução de carbodiimida e N-hidroxisulfosuccinimida, sulfo-NHS, em um tampão zwitteriônico. Esse tampão cria um pH adequado, permitindo que a carbodiimida e o sulfo-NHS ativem os grupos carboxila funcionalizados do chip, formando ésteres reativos à amina.

Adicione a solução de proteína alvo. As aminas primárias reagem com os ésteres reativos à amina, imobilizando as proteínas no chip por meio da formação de ligações amida. Adicione uma solução de têmpera contendo amina para bloquear ésteres reativos de amina não ligados, evitando ligações não específicas.

Insira o chip no leitor eletrônico e calibre-o com um buffer. O leitor aplica uma tensão constante entre os eletrodos. Mede-se o fluxo de corrente eléctrica resultante entre os eléctrodos na condição analito-não ligado.

Adicionar a concentração mais baixa da substância a analisar. A interação entre as proteínas do analito e os alvos imobilizados no chip altera a distribuição de carga local da superfície do grafeno, registrada como resposta I - a mudança no fluxo de corrente entre os eletrodos.

Após a gravação, lave com um tampão para dissociar os analitos ligados. Repetir a análise com concentrações crescentes da substância a analisar.

Um aumento gradual na resposta I com o aumento das concentrações do analito indica fortes IBPs entre o alvo e o analito.

Comece misturando volumes iguais de solução de EDC e sulfo-NHS pipetando para cima e para baixo. Coloque os chips de biossensor fornecidos pela empresa em uma placa de Petri de vidro com tampa ajustada. Sugere-se que todas as etapas de funcionalização envolvidas na ativação do chip sejam feitas dentro da placa de Petri. Aplique 50 microlitros de tampão MES de 1 molar no chip do biossensor. Incube por 1 minuto em temperatura ambiente.

Em seguida, aspire o tampão e aplique 50 microlitros de solução EDC/sulfo-NHS imediatamente no chip do sensor. Cubra a placa de Petri e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Aspire a solução EDC/sulfo-NHS do chip e aplique 50 microlitros de tampão MES de 1 molar.

Aspire o tampão MES e enxágue o chip duas vezes com 50 microlitros de 1x PBS. Aspire o PBS do chip e adicione a molécula alvo Hsp90. Cubra a placa de Petri de vidro e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire a solução contendo a molécula alvo e enxágue três vezes com 50 microlitros de 1x PBS.

Aspire a solução 1x PBS do chip e adicione 50 microlitros da solução Quench 1. Cubra a placa de Petri de vidro e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Aspire a solução Quench 1 do chip e adicione 50 microlitros da solução Quench 2. Cubra a placa de Petri de vidro e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, aspire a solução Quench 2 do chip e enxágue o chip cinco vezes usando 50 microlitros de 1X PBS deixando a última gota de PBS no sensor.

Preparar a série de diluições da substância a analisar para a Cdc37 no intervalo de concentração desejado. Conceber a experiência de modo a incluir pelo menos oito concentrações diferentes da substância a analisar para obter uma constante de dissociação fiável ou um valor K_d e preparar essas diferentes diluições no mesmo tampão utilizado para a calibração e a proteína-alvo.

Coloque o chip cuidadosamente no instrumento. Certifique-se de que o software esteja ligado e que a luz do LED fique verde. Em seguida, pressione o módulo "Run Experiment" no software automatizado e escolha "10 pontos com regeneração" ou qualquer outro protocolo desejado. Preencha os detalhes, como nome do operador, nome do experimento, data, buffer de regeneração, alvo imobilizado e o analito em solução. Pressione o botão "Iniciar experimento" exibido no software e siga as instruções mostradas pelo software automatizado.

Para realizar a calibração do instrumento, aspire a solução PBS restante do chip e aplique 50 microlitros do tampão de calibração. Pressione o botão 'Continuar' e aguarde cinco minutos até que a etapa de calibração seja concluída. O software exibe o ponto final determinado para a etapa de calibração com um alarme de aviso para acompanhamento.

Em seguida, execute uma associação de analitos aspirando o tampão de calibração do chip e aplicando 50 microlitros da menor concentração de analito. Pressione o botão 'Continuar' e aguarde cinco minutos até que a etapa de associação seja concluída. O software exibe o ponto final da etapa de associação com um alarme de aviso para prosseguir.

Para realizar uma dissociação do analito, aspire a solução do analito do chip e aplique 50 microlitros do tampão de dissociação. Pressione o botão 'Continuar'. Após a duração da etapa de dissociação, o software exibe o ponto final da etapa de dissociação com um alarme de aviso.

Em seguida, execute a regeneração do chip aspirando a solução de dissociação do chip e aplicando 50 microlitros do tampão de regeneração. Em seguida, pressione o botão 'Continuar'. A etapa de regeneração normalmente leva aproximadamente 30 segundos para ser concluída. Depois disso, o software exibe o ponto final da etapa de regeneração com o alarme de aviso a ser acompanhado.

Finalmente, para lavar o chip, aspire a solução de regeneração do chip e aplique 50 microlitros do tampão de lavagem. Aspire a solução do chip e repita isso cinco vezes. Deixe a última gota do tampão de lavagem no chip. Em seguida, pressione o botão 'Continuar' e aguarde 30 segundos até que a duração da etapa de lavagem termine no visor do software.

Repita as etapas para cada concentração de analito usada. As cinco etapas da calibração, associação de analitos, dissociação, regeneração e lavagem cinco vezes constituem um ciclo.