Fotometria de massa para estudar interações antígeno-anticorpo em um nível de molécula única

Para detectar interações antígeno-anticorpo usando fotometria em massa, primeiro, incube a concentração desejada de antígenos e anticorpos purificados pelo período de tempo necessário, facilitando a ligação antígeno-anticorpo. Com base na estequiometria da ligação ao antígeno, as regiões paratópicas desses anticorpos podem ter números variados de antígenos ligados.

Flua na solução contendo os anticorpos livres junto com os complexos antígeno-anticorpo através de uma câmara de fluxo pré-montada. Prenda a câmara no estágio de microscópio de um fotômetro de massa. Em seguida, direcione o feixe de laser através da câmara de fluxo para obter uma imagem ideal.

Dependendo do número de antígenos ligados a cada anticorpo, a massa molecular dos complexos muda. Essas variações na massa fazem com que os complexos espalhem a luz de maneira diferente.

Complexos com massas moleculares mais altas, onde dois antígenos estão ligados a ambos os parátopos de um único anticorpo, espalham mais luz em comparação com complexos contendo antígenos únicos. Além disso, os anticorpos livres mostram a menor quantidade de dispersão de luz.

Um detector coleta a luz espalhada e mede sua frequência e intensidade. O fotômetro registra flutuações na luz espalhada como um padrão de interferência, representando-o como pontos.

Manchas fracas correspondem a anticorpos livres. Em contraste, manchas muito escuras representam complexos com dois antígenos, e a mancha menos escura contém um antígeno ligado.

A presença de manchas escuras está de acordo com as interações antígeno-anticorpo.

Para avaliar a afinidade anticorpo-antígeno por fotometria de massa, aplique uma gota de óleo de imersão no microscópio na objetiva do instrumento e coloque a câmara de fluxo no palco do microscópio. Adicione 10 microlitros de PBS filtrado a uma extremidade do canal da câmara de fluxo. O tampão entrará no canal por ação capilar.

Na guia Controle de foco do software de coleta de dados, use os botões Up e Down de movimento grosseiro do stage para fazer os ajustes iniciais e clique em Nitidez para view a leitura do sinal de nitidez. Use os botões de ajuste para cima e para baixo para maximizar o valor de nitidez e clique em Definir foco e bloquear foco para ativar a função de rastreamento de foco. Uma imagem de um slide limpo deve ter um valor de "sinal" igual ou inferior a 0,05%.

Carregue 20 microlitros da primeira amostra de antígeno-anticorpo, conforme demonstrado, enxugando o líquido da outra extremidade com um pequeno pedaço de papel mata-borrão. Imediatamente após o carregamento, clique em Gravar para adquirir o número apropriado de quadros equivalente a 100 segundos de dados. No final do período de coleta de dados, insira um nome de arquivo para os dados e clique em OK e depois em Amostra para salvar o arquivo.

Para analisar os dados de fotometria de massa, abra o arquivo de interesse e clique em Analisar. Clique em Carregar para carregar a função de calibração e clique em Arquivo e Salvar resultados como para salvar os dados analisados.

Para obter as concentrações relativas de cada espécie na amostra, abra o arquivo "eventsFitted.csv", copie os dados da coluna M para o software de plotagem e análise apropriado e use a função Plot/Statistics/Histogram para traçar a distribuição de massa molecular. Clique duas vezes no histograma para abrir a janela Propriedades do gráfico, desative a compartimentalização automática e selecione um tamanho de compartimento de 2,5 kiloDaltons.

Para criar os dados de centralização e contagem de compartimentos, clique em Aplicar e ir. Para ajustar o histograma com funções gaussianas, selecione as colunas Centros de compartimento e Contagens e clique nas funções de menu Análise/Picos e Linha de base/Ajuste de pico múltiplo . Clique duas vezes para indicar as posições de pico aproximadas no gráfico de distribuição e clique em Abrir NLFit.

Marque as caixas de seleção Fixo para os centros "xc" e defina seus valores para as massas moleculares esperadas do anticorpo livre e dos complexos antígeno-anticorpo simples e duplo. Marque a opção Compartilhar para os parâmetros de largura e clique em Ajustar.

Os valores de altura dos picos ajustados dos componentes gaussianos representam a concentração relativa de cada espécie na amostra. Em seguida, use a equação para calcular a fração de concentração de cada espécie a partir dos valores de altura do pico.