Imagem FLIM-FRET para caracterização de interações proteína-proteína em bactérias vivas

Para estudar interações proteína-proteína específicas em bactérias vivas usando microscopia de imagem de fluorescência, FLIM, combinado com transferência de energia de ressonância de Förster, FRET, comece com uma suspensão bacteriana recombinante. As bactérias expressam proteínas citoplasmáticas específicas envolvidas em vias metabólicas, marcadas com proteínas fluorescentes doadoras e aceptoras, adequadas para FRET.

Localize a suspensão bacteriana em uma almofada de agarose, que imobiliza as bactérias em uma lâmina de microscópio. Coloque uma lamínula na lâmina e sele.

Posicione a lâmina no palco de um microscópio de varredura invertida de excitação de dois fótons para microscopia FLIM-FRET. Use uma lâmpada de fluorescência para selecionar e escanear uma região de interesse na monocamada bacteriana.

A interação entre as proteínas citoplasmáticas expressas aproxima as proteínas fluorescentes doadoras e aceptoras, na orientação apropriada. Após a iluminação do laser com um comprimento de onda adequado, a proteína fluorescente do doador fica excitada.

A proximidade das proteínas fluorescentes desencadeia o FRET, levando à transferência de energia não radiativa do doador para as prote