Imagem FLIM-FRET para caracterização de interações proteína-proteína em bactérias vivas
JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 4:26 min • July 8th, 2025
Para estudar interações proteína-proteína específicas em bactérias vivas usando microscopia de imagem de fluorescência, FLIM, combinado com transferência de energia de ressonância de Förster, FRET, comece com uma suspensão bacteriana recombinante. As bactérias expressam proteínas citoplasmáticas específicas envolvidas em vias metabólicas, marcadas com proteínas fluorescentes doadoras e aceptoras, adequadas para FRET.
Localize a suspensão bacteriana em uma almofada de agarose, que imobiliza as bactérias em uma lâmina de microscópio. Coloque uma lamínula na lâmina e sele.
Posicione a lâmina no palco de um microscópio de varredura invertida de excitação de dois fótons para microscopia FLIM-FRET. Use uma lâmpada de fluorescência para selecionar e escanear uma região de interesse na monocamada bacteriana.
A interação entre as proteínas citoplasmáticas expressas aproxima as proteínas fluorescentes doadoras e aceptoras, na orientação apropriada. Após a iluminação do laser com um comprimento de onda adequado, a proteína fluorescente do doador fica excitada.
A proximidade das proteínas fluorescentes desencadeia o FRET, levando à transferência de energia não radiativa do doador para as proteínas fluorescentes aceitadoras, que ficam excitadas e, eventualmente, retornam ao estado fundamental, emitindo fluorescência.
A transferência de energia não radiativa reduz o tempo necessário para a proteína fluorescente do doador excitado retornar ao seu estado fundamental, a vida útil da fluorescência do doador - medida pelo FLIM. A diminuição do tempo médio de vida de fluorescência da proteína fluorescente do doador devido ao FRET confirma a interação proteína-proteína na bactéria.
Coloque uma lâmina de vidro de microscópio em uma superfície horizontal plana e arrume duas lâminas de vidro cobertas com duas camadas de fita adesiva ao redor dela. Pipete uma gota de 70 microlitros de agarose derretida a 1% na lâmina de vidro e coloque uma quarta lâmina por cima para achatar a gota de agarose. Pressione suavemente por cerca de um minuto.
Retire a lâmina superior e solte cerca de três microlitros de bactérias em três a quatro pontos em diferentes locais da almofada de agarose. Cubra a almofada de agarose com uma lamínula de vidro de microscopia e fixe-a com parafina derretida para selá-la na lâmina de vidro, começando pelos quatro cantos.
Coloque a lâmina de microscopia no palco, com a lamínula voltada para a objetiva. Gire a torre do cubo do filtro para selecionar o cubo eGFP e abra a fluorescência lamp obturador. Em seguida, envie a luz de fluorescência para a ocular do microscópio. Concentre a objetiva nas bactérias usando o botão do microscópio.
Selecione uma região de interesse na amostra usando o joystick que controla a platina motorizada. Envie o caminho de emissão de fluorescência de volta para o detector e, em seguida, gire a torre do cubo do filtro para selecionar o cubo dicróico para o laser de 930 nanômetros e defina a potência do laser para 20 miliwatts. Defina o tamanho da região de interesse para 30 micrômetros, o que ajusta a tensão que opera os espelhos galvo e define o alcance de seus movimentos.
Ligue o detector e comece a escanear a amostra. Escolha o campo de visão para a imagem, finalmente movendo o palco da interface do computador. Isso pode ser feito na configuração movendo a cruz na imagem no software de controle do microscópio que definirá o novo centro da imagem e pressionando "Mover estágio".
Um bom campo de visão para aquisição deve conter de 10 a 30 bactérias imóveis, todas em foco. Se estiver interessado em extrair dados FLIM-FRET de células individuais, certifique-se de que as bactérias estejam bem individualizadas.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para estudar interações entre proteínas em bactérias vivas utilizando microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM) combinada com transferência de energia por ressonância de Förster (FRET). A abordagem envolve imobilizar bactérias que expressam proteínas marcadas com fluorescência em uma lâmina de microscópio e analisar suas interações por meio de alterações no tempo de vida da fluorescência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biofísica
- Biologia Celular
Contexto
- As interações entre proteínas são fundamentais para compreender os processos celulares.
- A técnica FLIM-FRET é uma poderosa abordagem para estudar essas interações em células vivas.
- As proteínas fluorescentes atuam como doadoras e aceptoras em experimentos de FRET.
- A imagem em tempo real permite a observação imediata das interações.
Objetivo do Estudo
- Investigar interações proteicas específicas em células bacterianas.
- Utilizar FLIM-FRET para medir alterações no tempo de vida da fluorescência.
- Ampliar a compreensão de vias metabólicas por meio de interações proteicas.
Métodos Utilizados
- Preparação de suspensão bacteriana recombinante expressando proteínas fluorescentes.
- Imobilização de bactérias em um suporte de agarose para microscopia.
- Uso de um microscópio invertido de varredura com excitação por dois fótons para obtenção de imagens.
- Medição do tempo de vida da fluorescência para avaliar a eficiência de FRET.
Resultados Principais
- Imobilização bem-sucedida de bactérias para imagem.
- Demonstração de FRET indicando interações proteína-proteína.
- Medição quantitativa das alterações no tempo de vida da fluorescência do doador.
- Validação do método para o estudo de interações metabólicas em bactérias vivas.
Conclusões
- O FLIM-FRET é eficaz para estudar interações proteicas em bactérias vivas.
- O método fornece informações sobre vias metabólicas e dinâmica proteica.
- Essa abordagem pode ser aplicada a diversas áreas de pesquisa biológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O FLIM-FRET permite a avaliação quantitativa de interações entre proteínas em sistemas bacterianos vivos, fornecendo subsídios mecanicistas para a regulação de vias metabólicas. Esta abordagem auxilia na validação de alvos ao confirmar associações funcionais entre proteínas em um contexto celular nativo, reduzindo a ambiguidade em testes iniciais de hipóteses. A técnica oferece confiança preditiva para desonerar alvos envolvidos no metabolismo bacteriano, orientando a priorização em programas de descoberta de antimicrobianos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Mede alterações no tempo de vida da fluorescência do doador para confirmar interações proteína-proteína em bactérias vivas expressando proteínas citoplasmáticas marcadas.
- Valor Operacional: Utiliza suspensões bacterianas recombinantes imobilizadas em lâminas de agarose para preparação e imagem consistente das amostras.
- Valor Científico: Quantifica a eficiência de FRET por meio da redução do tempo de vida da fluorescência, fornecendo dados objetivos para avaliação do engajamento do alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Permite a preparação de sistemas bacterianos validados que expressam eGFP doador e mCherry aceptor para triagem reprodutível de interações.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio de excitação a laser controlada em 930 nm e varredura definida de região de interesse (30 μm) para aquisição consistente de dados.
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas de tempo de vida da fluorescência que permitem a comparação da intensidade de interação entre diferentes condições ou mutantes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona interações proteicas observadas com a função da via metabólica, apoiando a desmistificação mecanicista de alvos em sistemas bacterianos.
- Valor Operacional: Proporciona continuidade do descobrimento à avaliação pré-clínica, permitindo a imagem de células vivas para interações dinâmicas em condições quase fisiológicas.
- Valor Científico: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco ao confirmar o engajamento do alvo em um contexto de células vivas relevante para a doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
FLIM-FRET insere-se no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos iniciais, especialmente para programas antimicrobianos que visam vias metabólicas bacterianas.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição de alterações no tempo de vida da fluorescência que confirmam interações proteicas específicas em bactérias vivas.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio por meio da imobilização padronizada de monocamadas bacterianas e seleção de regiões de interesse para obtenção de imagens reprodutíveis.
- Análises: Fornece medições quantitativas do tempo de vida da fluorescência que permitem às equipes comparar a eficiência de interações sob diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a validação de alvos à continuidade pré-clínica ao demonstrar interações funcionais entre proteínas em sistemas bacterianos vivos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade de imagem reutilizável para triagem de múltiplos pares de proteínas em modelos bacterianos ao longo de projetos de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao quantificar interações proteína-proteína por meio de alterações no tempo de vida da fluorescência.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de imobilização padronizada em lâminas de agarose e configurações controladas de excitação por dois fótons.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer dados objetivos de eficiência de FRET que reduzem a ambiguidade mecanicista na seleção de alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na força de interação confirmada em sistemas bacterianos vivos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência, aquisição de FLIM e seleção de pares FRET para marcação de proteínas bacterianas.
- Depende de microscópio invertido de varredura com excitação por dois fótons e laser ajustável (930 nm) com capacidade de detecção do tempo de vida de fluorescência.
- Necessita padronização dos protocolos de imobilização bacteriana e do tamanho da região de interesse (30 μm) entre usuários e laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes cepas bacterianas, condições de crescimento e níveis de expressão de proteínas fluorescentes.
- Inclui limitações práticas, como riscos de fotodesvanecimento e a necessidade de bactérias imóveis (10–30 células por campo) para extração confiável de dados.
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Última atualização: 22 agosto 2026