$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
No sistema nervoso, as interações transcelulares - interações entre moléculas específicas de adesão celular sináptica, proteínas transmembranares, em neurônios pré-sinápticos e pós-sinápticos - formam um complexo nas sinapses, mediando a sinalização trans-sináptica.
Para detectar interações transcelulares entre moléculas de adesão celular sináptica expressas em células renais embrionárias humanas por meio de um ensaio de agregação celular, comece com suspensões de células transfectadas.
Uma população de células transfectadas expressa a molécula de adesão celular pré-sináptica desejada e a proteína fluorescente verde; a outra expressa a molécula de adesão celular pós-sináptica específica e a proteína fluorescente vermelha. Duas populações de células expressando proteínas fluorescentes verdes e vermelhas também são obtidas.
Centrifugue as células. Ressuspenda as células em meios adequados suplementados com íons de cálcio. Misture as células transfectadas de ambas as populações igualmente em um tubo. Repita para as outras populações de células.
Durante a incubação, os íons de cálcio se ligam a um local específico na proteína pré-sináptica expressa em uma população de células. Isso aumenta a interação da proteína pré-sináptica com o ligante pós-sináptico da outra população de células, facilitando a ligação, mediando a adesão de células heterofílicas entre essas células e levando à agregação celular.
Sob um microscópio de fluorescência, faça a imagem das células usando canais adequados, visualizando a fluorescência verde e vermelha das células. Processe as imagens.
Nenhuma agregação é observada nas populações de células que expressam apenas as proteínas fluorescentes. A agregação celular é visualizada como amarela devido à sobreposição entre as células fluorescentes verdes e vermelhas que expressam as moléculas de adesão celular sináptica, sugerindo interações transcelulares entre as moléculas.
48 horas após a transfecção das células HEK293T, colha as células da placa de 6 poços para agregação. Primeiro, lave cada poço duas vezes com PBS. Em seguida, para dissociar suavemente as células, adicione 1 mililitro de EDTA 10 milimolar a cada poço. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius.
Após cinco minutos de incubação, bata suavemente na placa para separar as células e colha cada poço em um tubo cônico separado de 15 mililitros. Centrifugue os tubos a 500 x g à temperatura ambiente por 5 minutos.
Enquanto as células estão peletizando, prepare seis tubos de incubação rotulando os topos dos tubos de microcentrífuga com as condições experimentais. Todas as permutações de GFP e mCherry devem ser usadas.
Remova os sobrenadantes dos tubos cônicos de 15 mililitros e ressuspenda as células em 500 microlitros de meio. Usando um hemocitômetro, conte as células em cada tubo cônico. Em seguida, alíquota de 200.000 células de cada condição no tubo de incubação apropriado para uma mistura um-para-um em um volume total de 500 microlitros. Coloque os tubos de incubação em um rotador de tubo lento à temperatura ambiente.
Para avaliar a agregação, no início e novamente após 60 minutos, pipete 40 microlitros do tubo de incubação para uma lâmina de microscópio carregada. A aquisição da linha de base deve ser feita o mais rápido possível após a adição de células ao tubo da microcentrífuga.
Visualize o slide sob fluorescência nos canais verde e vermelho. Para cada slide, capture imagens de três campos de visão diferentes em um plano focal.