Ensaio de ligação de proximidade para estudar interações proteína-proteína in situ

Comece o ensaio de ligadura de proximidade pegando nematóides dissecados e fixando-os em uma lâmina com suas células germinativas expostas. Essas células exibem altos níveis de complexos ribonucleoproteicos contendo proteínas de ligação ao RNA, RBPs, associadas às proteínas parceiras.

Sobreponha a lâmina com dois anticorpos primários que reconhecem duas proteínas-alvo específicas - a RBP e sua proteína parceira. Complemente a lâmina com dois tipos de anticorpos secundários específicos para seus respectivos anticorpos primários.

Cada anticorpo secundário é conjugado com sondas de PLA - fitas de DNA com sequências complementares. Os anticorpos secundários se ligam aos anticorpos primários pré-ligados, aproximando as duas sondas PLA.

Aplique o tampão de ligação contendo oligonucleotídeos conectores - que hibridizam com sondas PLA - e a enzima ligase sela a lacuna, gerando DNA circular. Incube a lâmina com uma solução de amplificação contendo DNA polimerase, dNTPs e sondas detectoras conectadas a um fluoróforo vermelho.

Usando o DNA circularizado como modelo, a polimerase inicia uma amplificação do círculo rolante, gerando muitas cópias do DNA molde conectadas umas às outras. O DNA amp