Ensaio de ligação de proximidade para estudar interações proteína-proteína in situ

Comece o ensaio de ligadura de proximidade pegando nematóides dissecados e fixando-os em uma lâmina com suas células germinativas expostas. Essas células exibem altos níveis de complexos ribonucleoproteicos contendo proteínas de ligação ao RNA, RBPs, associadas às proteínas parceiras.

Sobreponha a lâmina com dois anticorpos primários que reconhecem duas proteínas-alvo específicas - a RBP e sua proteína parceira. Complemente a lâmina com dois tipos de anticorpos secundários específicos para seus respectivos anticorpos primários.

Cada anticorpo secundário é conjugado com sondas de PLA - fitas de DNA com sequências complementares. Os anticorpos secundários se ligam aos anticorpos primários pré-ligados, aproximando as duas sondas PLA.

Aplique o tampão de ligação contendo oligonucleotídeos conectores - que hibridizam com sondas PLA - e a enzima ligase sela a lacuna, gerando DNA circular. Incube a lâmina com uma solução de amplificação contendo DNA polimerase, dNTPs e sondas detectoras conectadas a um fluoróforo vermelho.

Usando o DNA circularizado como modelo, a polimerase inicia uma amplificação do círculo rolante, gerando muitas cópias do DNA molde conectadas umas às outras. O DNA amplificado permanece ligado à sonda PLA, permitindo a localização da interação proteína-proteína.

As sondas detectoras, carregando oligonucleotídeos curtos de fita simples, interagem com as regiões complementares do DNA amplificado, formando duplex e transmitindo sinais de fluorescência aos complexos de proteínas. Visualize a lâmina sob um microscópio de fluorescência.

Observe se há manchas vermelhas distintas dentro da célula, indicando interações proteína-proteína bem-sucedidas.

Use o diluente de anticorpos para diluir os anticorpos primários. Aplique 40 microlitros da solução de anticorpo primário diluído por 14 por 14 milímetros de espaço nas lâminas. Coloque as lâminas em uma câmara úmida e incube durante a noite a 4 graus Celsius.

De manhã, lave as lâminas duas vezes por 5 minutos cada com 50 mililitros de 1x tampão de lavagem A em temperatura ambiente em um frasco Coplin. Coloque o frasco Coplin em um agitador orbital ajustado para 60 RPM. Coloque as lâminas em uma toalha de papel para deixar o amortecedor de lavagem escorrer da lâmina e limpe suavemente as bordas.

Prepare uma solução de 40 microlitros contendo sondas positivas e negativas. Adicione a solução a cada espaço de 14 por 14 milímetros. Incube as lâminas em uma câmara úmida por 1 hora a 37 graus Celsius. Lave as lâminas duas vezes por 5 minutos cada com 50 mililitros de 1x tampão de lavagem A em temperatura ambiente em um frasco Coplin.

Coloque o frasco Coplin em um agitador orbital ajustado para 60 RPM. Dilua o tampão de ligação 1 a 5 com água ultrapura. Utilizar este tampão para diluir a ligase de 1 a 40 para preparar um stock de trabalho de solução de ligação. Coloque a lâmina em uma toalha de papel para deixar o tampão de lavagem escorrer pelas laterais e limpe suavemente as bordas.

Adicione 40 microlitros da solução de ligação a cada espaço de 14 por 14 milímetros. Incube as lâminas em uma câmara úmida por 30 minutos a 37 graus Celsius. Depois de lavar e secar as lâminas conforme descrito anteriormente, adicione 40 microlitros de solução de amplificação recém-preparada e protegida da luz a cada espaço de 14 por 14 milímetros.

Incube as lâminas na câmara úmida e escura por 1 hora e 40 minutos a 37 graus Celsius. Lave as lâminas duas vezes por 10 minutos cada com 50 mililitros de 1x tampão de lavagem B e lave as lâminas uma vez por 1 minuto com 50 mililitros de 0.01x tampão de lavagem B.

Depois de desenhar o perímetro revestido de epóxi da lâmina, adicione 10 microlitros de meio de montagem a cada amostra e coloque suavemente uma lamínula por cima, permitindo que o meio de montagem se espalhe. Pinte ao redor da borda da lamínula com esmalte para selar a lamínula e deslizar. Evite mover a lamínula. Deixe o esmalte endurecer por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz.