Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 6:15 min. • July 8th, 2025
Nas células, as proteínas se ligam às suas proteínas de interação por meio de sequências específicas em sua estrutura - modulando o funcionamento das proteínas intracelulares.
Para detectar interações de proteínas intracelulares, faça uma cultura de células aderentes. Aspire o meio.
Adicione um peptídeo de penetração celular biotinilado, solução de BCPP e incube.
Cada BCPP contém uma sequência peptídica que ajuda na ligação específica à proteína intracelular alvo. O peptídeo tem um peptídeo que penetra nas células, CPP, no terminal N do peptídeo e biotina no terminal C para facilitar a detecção.
Durante a incubação, a região CPP carregada positivamente facilita a entrada do peptídeo ligado através da membrana da célula, atingindo o citoplasma. O peptídeo se liga ao seu parceiro de proteína de interação intracelular - formando um complexo de proteína alvo BCPP.
Adicione um tampão contendo moléculas de detergente que rompem a membrana da célula e liberam complexos de proteínas-alvo BCPP e outros componentes celulares.
Adicione uma solução de avidina ligada a grânulos de agarose - uma glicoproteína que se liga especificamente à biotina em BCPPs. Incubar, permitindo a ligação irreversível da avidina à biotina e purificando os complexos proteicos-alvo avidina-BCPP.
Centrifugue para pellet as contas. Ressuspenda as esferas em um tampão para clivar as ligações não covalentes entre as proteínas e eluir os complexos CPP-peptídeo-proteína das esferas de biotina-avidina.
Analise os complexos CPP-peptídeo-proteína por western blotting. Uma banda de peso molecular mais alta para o complexo CPP-peptídeo-proteína do que os componentes do complexo indica uma interação bem-sucedida entre os parceiros de proteína que interagem.
Adicione o volume da solução-mãe de BCPP às culturas de células para atingir a concentração que se mostrou eficaz.
Portanto, adicione 92,8 microlitros de 2 miligramas por mililitro de TAT-Conexina-43266-283-Biotina por mililitro de meio de cultura. Coloque as células na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos, para garantir que as interações entre o BCPP e seus parceiros intracelulares ocorram.
Para realizar a extração de proteínas, primeiramente, aspire completamente o meio de cultura. Em seguida, lave as células com 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado por 150 centímetros, com muito cuidado para evitar o descolamento celular.
Para obter o lisado celular, adicione 3 mililitros de tampão de lise por frasco de 150 centímetros quadrados e raspe completamente a superfície usando um raspador de células. Inclinar o frasco para cerca de 45 graus facilitará a coleta dos lisados celulares em seus tubos correspondentes.
Despeje 1 mililitro do lisado celular por tubo em 3 tubos de 1,5 mililitro marcados por condição. Para o pull-down, centrifugue os tubos de 1,5 mililitro a 11.000 x g por 10 minutos a 4 graus Celsius.
Transfira os sobrenadantes para novos tubos rotulados como A. Transfira uma alíquota do sobrenadante por condição para diferentes tubos rotulados como B. Em seguida, adicione 16,6 microlitros de 4x tampão Laemmli para 50 microlitros de lisado e congele a menos 20 graus Celsius. Em seguida, homogeneizar muito bem a agarose NeutrAvidin agitando suavemente.
Corte as pontas das pontas da pipeta para aumentar seu diâmetro e melhorar a pipetagem das contas. Em seguida, adicione 50 microlitros de agarose NeutrAvidina por mililitro de lisado celular nos tubos A. Incubar os lisados celulares a 4 graus Celsius durante a noite com agitação muito suave para permitir que a NeutrAvidina interaja com os BCPPs ligados aos seus parceiros intracelulares.
Em seguida, centrifugue a 3.000 vezes g por 1 minuto a 4% graus Celsius para coletar o complexo de NeutrAvidina com proteínas. Remova cuidadosamente os sobrenadantes e transfira-os para tubos limpos rotulados como C. Guarde-os para uso caso o pull-down não seja bem-sucedido.
Para lavar o complexo de NeutrAvidina com proteínas, adicione tampão de lise fresco aos pellets dos tubos A. Ressuspender o pellet por inversão e repetir a centrifugação. Repita esta lavagem por mais cinco vezes. Todos esses sobrenadantes podem ser descartados.
Em seguida, adicione 40 microlitros de tampão Laemmli 2x por tubo de 1,5 mililitro para pellets obtidos de frascos de 150 centímetros quadrados de células confluentes. Em seguida, eluir a 100 graus Celsius por 5 minutos para dissociar as interações entre as proteínas.
Após a eluição, centrifugue por 30 segundos a 8.200 vezes g para granular os grânulos de NeutrAvidina. Transfira os sobrenadantes contendo as proteínas dissociadas com pontas capilares para novos tubos marcados como D.
Esses sobrenadantes estão agora prontos para serem carregados em um Western blot, conforme descrito no protocolo de texto, ou podem ser congelados a menos 20 graus Celsius.