Ensaio de dois híbridos de levedura para determinar a autoassociação de proteínas em células de levedura

Para o ensaio de dois híbridos de levedura, pegue uma suspensão de células de levedura de crescimento ativo geneticamente modificada sem a proteína ativadora de transcrição, GAL4. Essas células não podem sintetizar leucina e triptofano.

Adicione um par de plasmídeos de expressão: um que codifica leucina e o domínio de ligação ao DNA, DNA-BD, de GAL4, fundido a um domínio de proteína-alvo, e o outro que codifica triptofano e o domínio ativador, AD, de GAL4 fundido a outro domínio da proteína-alvo.

Adicione um buffer contendo agentes adequados para transformação. Choque térmico das células para causar a formação transitória de poros, facilitando a captação do plasmídeo celular. Deixe esfriar para selar novamente os poros. Coloque as células em um meio de crescimento seletivo sem leucina e triptofano.

As células transformadas que expressam duas proteínas híbridas sintetizam leucina e triptofano, sobrevivem e formam colônias.

O DNA-BD fundido a um domínio proteico se liga à sequência específica de DNA a montante da região promotora do gene codificador da β-galactosidase. Se os domínios da proteína alvo interagem, a DA e o DNA-BD se aproximam, causando a reconstituição do GAL4 funcional