Ensaio de purificação de afinidade em tandem para estudar interações proteína-proteína

A purificação por afinidade em tandem é um esquema de purificação sequencial para isolar complexos de proteínas das células para estudar as interações proteína-proteína.

Para começar, pegue uma cultura de células expressando proteínas de interesse marcadas com epítopos. As proteínas formam um complexo dentro da célula. Uma das proteínas do complexo contém uma etiqueta estreptocócica, enquanto a outra é marcada com uma etiqueta FLAG. Estas são pequenas marcas de afinidade baseadas em sequência de peptídeos sintéticos.

Remova o meio e adicione uma solução detergente para lisar as células. Centrifugue para remover os detritos celulares. Colete o sobrenadante contendo o complexo de proteínas-alvo e outras proteínas celulares.

Adicione contas de estreptococos - contas de agarose revestidas com estreptavidina - e incuba. A marca estreptocócica do complexo proteico liga-se à estreptavidina. Centrifugue para coletar as esferas ligadas ao complexo de proteínas. Lave para remover quaisquer proteínas celulares contaminantes.

Adicione tampão de eluição contendo destiobiotina - um derivado da biotina - que desloca o complexo proteico ligando-se competitivamente à estreptavidina. Centrifugar para obter um sobrenadante contendo o complexo proteico eluído.

Adicione grânulos FLAG - grânulos de agarose revestidos com anticorpos anti-FLAG - e incuba. A etiqueta FLAG do complexo proteico se liga ao anticorpo. Centrifugue para coletar as esferas ligadas ao complexo de proteínas.

Adicione tampão de eluição contendo peptídeo FLAG livre. O peptídeo se liga competitivamente ao anticorpo e desloca o complexo proteico ligado. Centrifugar para eluir o complexo proteico purificado.

Avalie a presença de ambas as proteínas na eluição para confirmar a interação entre as proteínas de interesse.

Depois de as misturas de lisado celular e de chorume STREP-bead terem sido incubadas durante 2 horas, centrifugá-las a 1,1500 vezes g durante 2 minutos a 4 graus Celsius. Salve o sobrenadante como "STREP AP flow-through" e armazene a 4 graus Celsius.

Adicione 500 microlitros de STREP AP Wash Buffer 1 aos grânulos. Nuque as esferas e a mistura tampão por 5 minutos a 4 graus Celsius e centrifugue a 1.500 vezes g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e lave novamente com 500 microlitros de STREP AP Wash Buffer 1.

Após a terceira lavagem, transfira a solução do grânulo para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para reduzir o fundo da proteína. Lave uma quarta vez com o STREP AP Wash Buffer 1. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e adicione 500 microlitros de tampão de lavagem 2.

Equilibre as contas invertendo os tubos e, em seguida, gire para baixo a 1.500 vezes g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante. Eluir a proteína de interesse com 50 microlitros de tampão de eluição STREP. Vórtice a 800 RPM por 15 minutos a 4 graus Celsius. Gire as contas a 1500 vezes g por 1 minuto a 4 graus Celsius. Colete o sobrenadante. Esta fração corresponde à amostra de "eluição STREP AP

Guarde a fração de grânulos a 4 graus Celsius para uma segunda eluição. Alíquota de 10% da eluição STREP AP para coloração de prata e/ou western blotting.

Para aumentar a quantidade de material de partida para a imunoprecipitação FLAG subsequente, a primeira e a segunda eluições STREP podem ser agrupadas para uma recuperação mais eficiente da eluição FLAG.

Comece este procedimento usando uma ponta de pipeta de boca larga para transferir a quantidade apropriada de solução de esferas FLAG para um tubo de microcentrífuga. Gire para baixo a 1.500 vezes g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Remova o sobrenadante e adicione 500 microlitros de tampão de lavagem FLAG aos grânulos.

Gire para baixo a 1.500 vezes g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e lave novamente com tampão de lavagem FLAG. Após a terceira lavagem, remova o sobrenadante e ressuspenda os grânulos no tampão de lavagem FLAG até um volume final de n vezes 16 microlitros, onde n é o número de amostras.

Adicione 16 microlitros da pasta de esferas FLAG à eluição STREP AP restante e nutate durante a noite a 4 graus Celsius. Após uma incubação noturna da pasta de esferas FLAG e eluição STREP AP, prossiga com a imunoprecipitação FLAG.

Gire a suspensão dos grânulos FLAG a 1.500 vezes g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Salve o sobrenadante como o "fluxo FLAG IP" e armazene a 4 graus Celsius.

Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem FLAG aos grânulos. Nute por 5 minutos a 4 graus Celsius e centrifugue a 1.500 vezes g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e lave novamente com 500 microlitros de tampão de lavagem FLAG.

Após a terceira lavagem, transfira a solução de esferas de proteína para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para reduzir o fundo. Lave uma quarta vez com o tampão de lavagem FLAG. Remova o sobrenadante da centrifugação final e adicione aos grânulos 30 microlitros de tampão de lavagem FLAG contendo 200 nanogramas por microlitro de peptídeo FLAG. Vórtice a 800 RPM por duas horas a 4 graus Celsius.

Após duas horas, gire a suspensão a 1.500 vezes g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Colha o sobrenadante e armazene a 4 graus Celsius como a "eluição FLAG IP".