Ensaio de purificação de afinidade em tandem para estudar interações proteína-proteína

A purificação por afinidade em tandem é um esquema de purificação sequencial para isolar complexos de proteínas das células para estudar as interações proteína-proteína.

Para começar, pegue uma cultura de células expressando proteínas de interesse marcadas com epítopos. As proteínas formam um complexo dentro da célula. Uma das proteínas do complexo contém uma etiqueta estreptocócica, enquanto a outra é marcada com uma etiqueta FLAG. Estas são pequenas marcas de afinidade baseadas em sequência de peptídeos sintéticos.

Remova o meio e adicione uma solução detergente para lisar as células. Centrifugue para remover os detritos celulares. Colete o sobrenadante contendo o complexo de proteínas-alvo e outras proteínas celulares.

Adicione contas de estreptococos - contas de agarose revestidas com estreptavidina - e incuba. A marca estreptocócica do complexo proteico liga-se à estreptavidina. Centrifugue para coletar as esferas ligadas ao complexo de proteínas. Lave para remover quaisquer proteínas celulares contaminantes.

Adicione tampão de eluição contendo destiobiotina - um derivado da biotina - que desloca o complexo proteico ligando-se competitivamente à estreptavidina. Centrifugar par