Ressonância plasmônica de superfície para estudar interações biomoleculares usando um chip sensor

Para realizar a ressonância plasmônica de superfície, ou SPR, para estudar as interações biomoleculares, comece com um chip sensor posicionado sobre um detector SPR em uma célula de fluxo. Este chip sensor revestido de metal possui uma camada de material de hidrogel depositado na superfície do chip, tornando-o mais adequado para imobilização de proteínas.

Cubra o chip com peptídeos virais, que interagem com o hidrogel e imobilizam na superfície. Lavar com uma solução alcalina de têmpera que evite interacções proteicas inespecíficas.

Direcione a luz polarizada para o chip. No ângulo de ressonância, os elétrons metálicos absorvem essa luz e ressoam, reduzindo a intensidade da luz refletida no ângulo refletido correspondente.

O fotodetector coleta essa luz refletida e o processador converte esse sinal em linha de base, gerando um sensorgrama - um gráfico que representa a resposta do sensor em relação ao tempo.

Flua uma solução de agente antiviral para a célula de fluxo. Durante o fluxo, os agentes antivirais interagem com os peptídeos virais imobilizados no chip. Essa associação altera o índice de refração, que altera o ângulo e a intensidade da luz refletida, resultando em uma resposta do sensor.

Adicione um tampão de lavagem de alta força iônica que interrompa a interação entre as duas moléculas, levando à sua dissociação e diminuindo a resposta do sensor.

Analise a forma do sensorgrama e avalie a associação e dissociação das duas moléculas cruciais nas interações biomoleculares.

Para o sistema SPR de canal duplo, use HBS-EP+ como tampão de funcionamento, ácido clorídrico glicina 10 milimolares de pH 1.5 a 1.6 como tampão de regeneração e ligue o desgaseificador do instrumento, o amostrador automático e a bomba. Em seguida, lave todo o sistema com água bidestilada por 1 hora.

Em seguida, coloque óleo de imersão no detector e monte um chip sensor de vidro revestido com uma fina película de ouro e, na parte superior, funcionalizado com hidrogel de carboximetildextrano diretamente no detector abaixo da célula de fluxo de três portas. Em seguida, corrija a configuração puxando para baixo o manuseio.

Para imobilizar os ligantes proteicos nos chips sensores, abra uma tabela de execução clicando em Formulário na barra de menus e Execute o Editor de tabelas no software SPRAutoLink integrado. Em seguida, escolha e clique em BASIC_Immobilization na lista de tabelas de execução disponíveis e siga as etapas do procedimento experimental na tela do computador.

Em seguida, clique em Editor de conjunto de amostras na seção Formulário para preencher a lista de reagentes para dois racks colocados no amostrador automático para análises posteriores. Clique em Autosampler Sampler Direct Control como uma ferramenta na barra de menus para trazer os racks para frente ou para casa e escolha 4 graus Celsius como a temperatura de operação.

Inicie a bomba para infundir água bidestilada clicando em Ferramentas e "Controle Direto da Bomba" e registre os dados clicando em "Controle Direto do Instrumento SPR" e, a cada vez, inicie na janela que aparece recentemente. Depois de adicionar os reagentes de acoplamento em frascos de 300 microlitros, coloque-os nos racks do amostrador automático e inicie a tabela de execução clicando em Executar.

Para a interação proteína-proteína simples após reabastecer a bomba a 25.000 microlitros por minuto, execute o ajuste da linha de base por 30 segundos. Permitir o ajuste da linha de base subsequente com água bidestilada durante 1,5 minutos antes de extinguir a superfície da microplaqueta ativada com cloridrato de etanolamina 1 molar, pH 8,5. Em seguida, troque os tubos do amostrador de líquido para o desgaseificador de água bidestilada para a garrafa com HBS-EP+.

Clique em Formulário, role para baixo e mude para "Pós-processamento" clicando neste modo de operação. Em seguida, clique em Adicionar para selecionar as curvas de vinculação geradas ao longo do tempo no formulário de plotagem de dados para cada célula de fluxo e exporte a sobreposição como um arquivo de depuração. Em seguida, clique em Arquivo para abrir as opções de salvamento de arquivos e obter curvas de resposta alinhando as curvas esquerda e direita e subtraindo os sinais do segundo canal de referência daqueles do canal ligante.