JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 6:05 min • July 8th, 2025
A espectroscopia de ressonância magnética nuclear, ou RMN, permite a detecção de interação proteína-proteína em nível atômico.
Para estudar as interações entre proteínas globulares e helicoidais, rotule proteínas globulares purificadas do tipo selvagem ou mutantes com 15N - um isótopo de nitrogênio. Em um tubo de RMN, misture as proteínas globulares e helicoidais não marcadas em um solvente contendo um padrão de RMN. Insira o tubo no espectrômetro de RMN.
Os ímãs do espectrômetro geram um forte campo magnético, alinhando os 15núcleos de proteínas globulares marcados com N paralelos ao campo. Um pulso de radiofrequência, ou RF, excita os 15núcleos N para se alinharem antiparalelos ao campo.
A frequência de pulso necessária para a transição de núcleos de 15N entre os dois estados define a frequência de ressonância. A normalização da frequência de ressonância de 15N para o padrão de RMN mede o deslocamento químico de 15N.
O campo magnético é ajustado para alinhar os núcleos 1H - ligados a 15N - paralelos ao campo. Os pulsos de RF são ajustados e o deslocamento químico de 1H é registrado.
Durante as interações proteicas, o ambiente químico ao redor dos resíduos de aminoácidos em interação muda, alterando as ligações químicas 15 N-1H e os deslocamentos químicos correspondentes. Plote os 15espectros de RMN N-1H.
Sem proteínas helicoidais, as proteínas globulares do tipo selvagem exibem picos espectrais bem resolvidos. Quando as proteínas globulares helicoidais e selvagens interagem, o pico espectral é reduzido. Em contraste, a incubação de proteínas helicoidais com proteínas globulares mutantes resulta no reaparecimento dos picos espectrais, indicando que não há interação entre elas.
Ligue o fluxo de ar com o comando de ejeção "ej". Isso trará a amostra do ímã. Agora, coloque a amostra dentro de um spinner em cima do ímã na abertura. Insira com o comando "ij". Aguarde até que a amostra se acomode dentro do ímã antes de prosseguir.
Crie um novo conjunto de dados usando o comando "edc" e carregue os parâmetros NMR do Proton padrão selecionando o experimento "ZGPR". Preencha os campos nome, número do experimento e número da pasta de dados processados.
Selecione o solvente no campo "Set Solvent" e clique em "Execute 'getprosol'" para ler o cabeçote padrão e os parâmetros dependentes do solvente. Bloqueie a amostra no solvente deuterado usando o comando "Bloquear" e espere até que termine de varrer e atinja o bloqueio.
Corrija a frequência de ressonância do ímã sintonizando a amostra usando o comando de sintonia automática "atma". Monitore a curva de oscilação até que o ajuste automático seja concluído.
Calce o campo magnético usando "TOPSHIM". Shimming faz ajustes no campo magnético para obter uniformidade ao redor da amostra. É uma boa prática armazenar os mesmos valores com o comando "wsh" e lê-los usando "rsh" antes do topshim se estiver usando amostras iguais ou semelhantes.
Agora, ajuste o ganho do receptor com o comando "rga" para obter a relação sinal-ruído máxima. Coloque o centro do espectro no deslocamento de ressonância da água e defina o pulso de prótons de 90 graus em alta potência usando "calibo1p1".
Colete o espectro de prótons usando o comando Zero Go "zg" e processe com "efp". Isso inclui multiplicação exponencial, o decaimento de indução livre incorporando alargamento de linha, transformação de Fourier de FID e "pk" para aplicar correção de fase.
Aplique a correção automática de fase "apk" e a correção automática de linha de base "absn" usando a opção polinomial sem integração. Crie um novo conjunto de dados para o experimento SOFAST HMBC selecionando "SFHMQC3GPPH" no experimento.
Copie o P1 e O1 otimizados do espectro de prótons e preencha os pulsos dependentes de P1 usando o comando "getprosol 1H p1 plw1", onde P1 é o valor P1 otimizado e plw1 é o nível de potência para P1. Agora, otimize a constante CNST54 para definir o deslocamento para o deslocamento químico da amida. Além disso, otimize o CNST55 para definir a largura de banda a fim de abranger as regiões espectrais de interesse, permitindo que o ganho do receptor seja otimizado.
Para selecionar esses parâmetros, extraia o primeiro FID do espectro bidimensional e procure o sinal observado para defini-los. Além disso, varie o atraso de relaxamento, o número de varreduras e as varreduras fictícias para obter uma sensibilidade de sinal aceitável com o comando "gs", que permite que go e scan monitorem a qualidade dos dados em tempo real. Finalmente, registre os espectros usando Zero Go "zg".