Usando a exibição de fagos para selecionar proteínas com alta afinidade com uma proteína-alvo

Comece a exibição de fagos adicionando uma biblioteca de fagos aos poços de uma placa de vários poços, revestida com proteína-alvo. A biblioteca de fagos contém fagos geneticamente modificados, cada um exibindo uma variante de proteína individual fundida a uma proteína de revestimento em sua superfície. Incubar, permitindo que o fago e as proteínas-alvo interajam.

Fagos com proteínas com alta afinidade por proteína-alvo ligam-se à proteína-alvo. Lave com um tampão, removendo os fagos não ligados. Adicione uma solução ácida, interrompendo as interações entre o fago e a proteína-alvo, liberando fagos na solução. Neutralize o pH da solução usando um tampão, mantendo a estabilidade do fago.

Transfira os fagos para um novo tubo. Incubar com uma solução de bloqueio contendo proteínas, evitando interações inespecíficas.

Transfira os fagos para uma suspensão de E. coli que se divide ativamente, infectando bactérias e iniciando o ciclo de replicação do fago. Suplemento com fagos auxiliares, que infectam as bactérias, fornecendo proteínas de revestimento necessárias para embalar os fagos da progênie. Transfira a suspensão para um meio seletivo, permitindo o crescimento de bactérias infectadas por fagos.

Os fagos da progênie eventualmente são liberados no meio. Centrifuga. Colete o sobrenadante contendo fagos. Adicione uma solução de precipitação, concentrando as partículas de fago. Centrifuga. Ressuspenda o grânulo em um tampão, obtendo uma suspensão homogênea.

Realizar rodadas subsequentes de seleção de fagos; repetir a ligação da proteína fago-alvo, eluição com uma etapa de rigor de lavagem de tampão aumentada e etapas de amplificação e centrifugação, resultando no enriquecimento de pools de fagos exibindo proteínas com alta afinidade com a proteína alvo.

Descongele a biblioteca de fagos no gelo. Em seguida, dilua-o para 100 vezes a diversidade de bibliotecas na PBS. Adicione a solução de polietilenoglicol/cloreto de sódio a 1/5 do volume diluído da biblioteca e incube a solução em gelo por 30 minutos. Em seguida, centrifugue a solução a 11.000 vezes g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante e centrifugá-lo durante mais dois minutos para retirar o sobrenadante restante e concentrar o sedimento de fago.

Ressuspenda suavemente o pellet de fago em um mililitro de tampão PBT por proteína-alvo a ser analisada, normalmente, quatro no total. Adicione 100 microlitros de biblioteca de fagos a cada poço revestido na placa de controle. Incube-o em temperatura ambiente por uma hora com agitação orbital de 300 RPM.

Descarte o buffer PB da placa alvo na pia e seque a placa em papel toalha. Transfira todos os 100 microlitros da biblioteca de fagos na placa de controle para cada poço revestido da placa alvo. Incube-o em temperatura ambiente por uma hora com agitação orbital de 300 RPM.

Em seguida, remova a biblioteca de fagos da placa e lave os poços revestidos quatro vezes com tampão PT. Inverta o prato e bata em uma toalha de papel para remover as últimas gotas de tampão. Adicione 100 microlitros de ácido clorídrico 0,1 molar a cada poço revestido para eluir o fago. Incubar a placa à temperatura ambiente durante 5 minutos com agitação orbital de 300 RPM.

Depois disso, neutralize o pH adicionando 12,5 microlitros de cloridrato de Tris de pH 11 a cada poço revestido. Transfira o fago eluído de todos os oito poços para um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Pipete para cima e para baixo durante a transferência para tornar as soluções homogêneas e aspire todo o líquido dos poços. Adicione 10% de BSA ao fago eluído para tornar a concentração final de 1%.

Armazene o tubo da microcentrífuga a quatro graus Celsius. Esta é a saída da primeira rodada. Prepare uma cultura de sementes para cultivar a entrada de fagos para a próxima rodada de seleção, inoculando cinco mililitros de cultura de sementes de 2YT / Tetraciclina com uma colônia isolada de E. coli de uma placa de ágar.

Incube-o durante a noite a 37 graus Celsius com agitação orbital de 200 RPM. Diluir a proteína alvo nos tubos das carreiras dois e três com uma quantidade adequada de PBS. Pegue metade do conteúdo do tubo das rodadas dois e três e cubra quatro poços por proteína-alvo em uma placa de ligação de 96 poços para a próxima rodada.

Em seguida, use metade da saída redonda para inocular três mililitros de células da fase intermediária. Incube-o a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação orbital de 200 RPM. Adicione o fago auxiliar M13KO7 a uma concentração final de 10 bilhões de pfu por mililitro. Incube-o novamente a 37 graus Celsius por uma hora com agitação orbital de 200 RPM.

Após uma hora, transfira todos os três mililitros de cultura para 30 mililitros de solução de 2YT / carbenicilina / canamicina. Cresce durante a noite a 37 graus Celsius com agitação orbital de 200 RPM.