Microscopia de localização fotoativada acoplada à complementação de fluorescência bimolecular

Em sua forma ativa, o monômero Ras associado à membrana plasmática - uma proteína de ligação ao nucleotídeo guanina - recruta Raf, uma proteína quinase inativa que se liga a Ras por meio de seu domínio de ligação a Ras.

Essa ligação resulta em um complexo Ras-Raf funcional que aciona o processo de sinalização downstream.

Para visualizar a interação Ras-Raf intracelular, comece com uma suspensão de células geneticamente modificadas em uma lâmina bem compartimentada. Essas células expressam duas proteínas de fusão não fluorescentes - uma compreende Ras ligada a metade de um fluoróforo fotoativável por meio de seu terminal N, e a outra é Raf fundida à outra metade do mesmo fluoróforo em seu terminal C.

Dentro das células, as proteínas de fusão contendo Ras se encaixam na membrana plasmática e interagem com proteínas de fusão contendo Raf, reconstituindo os fragmentos da proteína fluorescente em um fluoróforo fotoativável completo. A ausência de ligação de Ras e Raf mantém as duas metades do fluoróforo separadas.

Adicione um reagente fixador à lâmina. As moléculas fixadoras formam ligações cruzadas com as proteínas e estabilizam os complexos proteicos.

Remova o reagente fixador e adici