Imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação de proteínas-alvo no DNA genômico

Para identificar os locais de ligação de uma proteína-alvo no DNA, comece com células precursoras de oligodendrócitos contendo uma proteína-alvo reticulada a sequências específicas de DNA na cromatina.

Trate as células com um tampão de lise contendo inibidores de protease. O tampão de lise lisa as células, enquanto os inibidores inativam proteases para reter a integridade dos complexos proteína-cromatina.

Sonicar o conteúdo para cisalhar os complexos em fragmentos menores de cromatina, com alguns retendo a proteína alvo.

Centrifugue para pellet os componentes da célula e transfira o sobrenadante contendo fragmentos de cromatina para um novo tubo. Incubar com anticorpos anti-alvo que se ligam especificamente à proteína-alvo nos fragmentos de cromatina.

Complemente o tubo com esferas magnéticas revestidas com proteína A que se ligam à região Fc de anticorpos pré-ligados. Aplique um campo magnético para precipitar seletivamente as proteínas-alvo ligadas a anticorpos complexadas com fragmentos de cromatina.

Trate os complexos de esferas com um tampão de eluição com alto teor de sal para interromper as interações proteína-cromatina e liberar o DNA nu sem proteínas associadas.

Use solventes orgânicos para extrair o DNA. Adicione um tampão de amplificação e execute uma reação em cadeia da polimerase para amplificar os fragmentos de DNA. Pós-amplificação, analise a sequência de DNA.

Compare a sequência dos produtos amplificados com a sequência de DNA genômico da célula. Encontre a região com uma correspondência de sequência entre o fragmento e o DNA genômico - correlacionando-se com os locais de ligação às proteínas.

Após a contagem em um hemocitômetro, adicione 20.000 OPCs purificados em 1 mililitro de meio de cultura de células OPC para a reação ChIP. Em seguida, adicione 27 microlitros de 36,5% de formaldeído em temperatura ambiente por 10 minutos. Isso corrigirá as células.

Após 10 minutos, adicione 50 microlitros de glicina 2,5 molar nas células fixas por 5 minutos em temperatura ambiente. A adição da glicina interromperá a reticulação DNA-proteína. Em seguida, lave as células reticuladas com 1 mililitro de tampão HBSS com coquetel inibidor de protease. Em seguida, centrifugue as células em uma centrífuga pré-resfriada a 300 vezes g a 4 graus Celsius.

Após a reticulação dos OPCs purificados, as células reticuladas devem ser lavadas com solução HBSS gelada, e as etapas restantes do ChIP devem ser realizadas a 4 graus. Caso contrário, o anticorpo não pode precipitar o DNA genômico adequadamente.

Em seguida, adicione 25 microlitros de tampão de lise completo ao pellet celular e deixe no gelo por 5 minutos. Em seguida, pipete 75 microlitros de tampão HBSS gelado com coquetel inibidor de protease. Em seguida, cisalhamento da cromatina do lisado celular em um sistema de sonicação pré-resfriado com cinco ciclos de 30 segundos de programa ON e 30 segundos OFF.

Uma vez que a cromatina é cortada, centrifugue o lisado celular a 14.000 vezes g por 10 minutos a 4 graus Celsius. No final da centrifugação, recolher o sobrenadante. Em seguida, dilua 100 microlitros da cromatina cisalhada com um volume igual do tampão ChIP gelado com inibidor de protease.

Em seguida, adicione 1 microlitro de anticorpo anti-olig2 Rabbit a 180 microlitros da cromatina cortada diluída. Incube os tubos em uma roda giratória por 16 horas a 4 graus Celsius a 40 rotações por minuto. Em seguida, adicione 10 microlitros de esferas revestidas com proteína A pré-lavadas ao tubo de reação ChIP em uma câmara fria. Novamente, incube os tubos ChIP a 4 graus Celsius por mais 2 horas na roda giratória.

Após 2 horas, deixe o tubo de reação ChIP no rack magnético por um minuto. Em seguida, lave o pellet com 100 microlitros de quatro tampões de lavagem cada por 4 minutos em uma roda giratória a 4 graus Celsius. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de eluição ao pellet do grânulo. Incubar o tubo de reação a 65 graus Celsius por 4 horas.

Uma vez que o DNA de fita dupla é desnaturado, desfosforile a extremidade 3-prime do DNA de fita simples adicionando fosfatase alcalina de camarão. Em seguida, adicione cauda poli (T) ao DNA de fita simples usando desoxinucleotidil transferase terminal. Em seguida, recoza o primer de DNA poli-(dA) para o molde de DNA de fita simples. Em seguida, amplifique a biblioteca de sequências ChIP usando primers diretos e reversos para indexação.

O número de ciclos de PCR para preparação da biblioteca depende da quantidade de DNA inicial. Uma boa preparação da biblioteca requer uma quantificação precisa da quantidade de DNA de entrada. Muitos ou poucos ciclos de PCR podem influenciar a concentração da biblioteca, bem como a complexidade, levando a artefatos de PCR.

Use grânulos paramagnéticos para selecionar os fragmentos que variam de 250 a 500 pares de bases da biblioteca de sequências ChIP amplificada por PCR. Use um dispositivo de eletroforese capilar ChIP microfluídico para examinar a qualidade da biblioteca de sequências ChIP selecionada.