Por que medir a anisotropia de fluorescência é importante para a validação de alvos?

A anisotropia de fluorescência quantifica alterações na rotação molecular decorrentes da ligação entre fator de transcrição e DNA, fornecendo uma medida direta da afinidade de ligação e da formação de complexos. Isso permite a avaliação objetiva do engajamento com o alvo e da especificidade, aspectos essenciais para a validação de alvos transcricionais na fase inicial de descoberta.

Como o isolamento da variável independente da concentração de DNA competidor apoia o processo de descoberta?

Ao variar a concentração de DNA competidor mantendo constante o DNA marcado e o fator de transcrição, o ensaio isola o efeito do deslocamento competitivo na ligação. Isso permite a determinação precisa de constantes de dissociação e afinidades relativas de ligação entre diferentes sequências de DNA ou mutantes.

Quais medidas quantitativas da variável dependente permitem a determinação da afinidade de ligação?

O ensaio mede a anisotropia de fluorescência como variável dependente, que aumenta com a ligação do fator de transcrição devido à rotação molecular mais lenta e diminui quando o DNA competidor desloca a sonda marcada. Essas alterações são representadas graficamente em função da concentração do competidor para gerar curvas de titulação e calcular as constantes de dissociação.

Por que os requisitos de replicação são importantes para a colaboração multifuncional?

Medições replicadas em poços e experimentos garantem a confiabilidade dos sinais de anisotropia de fluorescência e do ajuste das curvas de titulação, o que é essencial para gerar constantes de dissociação consistentes. Essa reprodutibilidade apoia o compartilhamento de dados entre equipes de biologia, química medicinal e desenvolvimento de ensaios para tomada de decisões alinhada.

Quais são as capacidades de análise estatística necessárias antes de implementar este ensaio?

A implementação exige a capacidade de ajustar curvas de titulação de ligação para extrair constantes de dissociação e concentrações ativas de proteína, normalmente utilizando regressão não linear em softwares como o HiP-FA. As equipes também devem validar as relações sinal-ruído e a consistência entre réplicas para garantir a quantificação precisa dos parâmetros de ligação.

Anisotropia de fluorescência para determinar a afinidade de ligação do fator de transcrição-DNA

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas Biológicas

0 vistas • 5:00 min • July 8th, 2025

O fator de transcrição, TF, é uma proteína que se liga à região específica do DNA de um gene e regula a transcrição.

Para medir as interações TF-DNA por anisotropia de fluorescência, pegue uma placa de vários poços. Adicione gel fundido misturado com uma solução tamponada, contendo concentrações conhecidas de DNA de referência marcado com fluoróforo, compreendendo um local de ligação de TF e uma concentração mais alta de moléculas de TF, ao poço e incuba.

À medida que o DNA de referência marcado se distribui no gel, uma concentração mais alta da molécula de TF garante que todas as moléculas de DNA sejam ligadas ao TF. Adicione uma solução tamponada contendo DNA concorrente não rotulado com uma mutação de ponto único.

Analise o gel da placa usando microscopia de anisotropia de fluorescência de alto desempenho.

A luz polarizada excita o fluoróforo ligado ao DNA de referência, que se reorienta devido à queda molecular e emite luz despolarizada multidirecional - um fenômeno chamado anisotropia de fluorescência, FA.

Ao se ligar ao TF, o peso molecular do fluoróforo ligado ao DNA de referência aumenta e ele cai mais devagar, emitindo mais luz polarizada que aumenta o FA.

O DNA concorrente não rotulado se difunde pela matriz de gel ao longo do tempo, formando um gradiente de concentração alto a baixo. Uma concentração mais alta de DNA concorrente não rotulado desloca o DNA de referência marcado, ligando-se ao TF. Os oligômeros de referência rotulados liberados caem mais rápido, diminuindo a FA.

Plote o FA do fluoróforo e o gradiente de concentração do DNA concorrente ao longo do tempo - que diminui à medida que mais moléculas de DNA concorrentes deslocam o DNA de referência.

Para preparar os poços de titulação e calibração de uma placa de 96 poços, transfira duas alíquotas de estoque de gel para um agitador de incubadora de 75 graus Celsius.

Para cada poço de titulação, adicione 1,4 nanomoles de DNA de referência, proteína do fator de transcrição em uma concentração final de 20 a 60 nanomoles, 0,2 milimolar DTT e o tampão de ligação a 240 microlitros do gel derretido.

Misture bem invertendo e agitando o tubo. Em seguida, pipete lentamente 200 microlitros por poço do gel contendo DNA nos poços de titulação designados de uma placa de 96 poços. Para cada poço de calibração, adicione 5 nanomoles de corante azul do Nilo a 240 microlitros do gel derretido. Evitando bolhas de ar, pipete lentamente 200 microlitros da solução de gel contendo corante em cinco a seis poços da placa de 96 poços.

Coloque o gel em uma superfície perfeitamente horizontal e incube por 10 minutos em temperatura ambiente e outros 10 minutos a 4 graus Celsius. Use um leitor de placas multipoços para verificar a homogeneidade dos níveis de altura do gel em diferentes poços da placa.

Para preparar a solução de DNA concorrente, primeiro combine o DNA de referência marcado, a proteína e o tampão de ligação concentrado triplo. Em seguida, misture 20 microlitros da solução com 40 microlitros de cada uma das soluções de DNA concorrente recozidas.

Para cada alvéolo de calibração, combinar as quantidades adequadas de uma das soluções de ADN concorrente recozidas e o tampão de ligação concentrado triplo contendo uma solução de corante azul do Nilo a 15 milimolares. Por fim, adicione 50 microlitros das soluções mistas da concorrência em cima dos géis o mais simultaneamente possível.

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Última atualização: 29 agosto 2026

Anisotropia de fluorescência para determinar a afinidade de ligação do fator de transcrição-DNA

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