Anisotropia de fluorescência para determinar a afinidade de ligação do fator de transcrição-DNA
Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 5:00 min. • July 8th, 2025
O fator de transcrição, TF, é uma proteína que se liga à região específica do DNA de um gene e regula a transcrição.
Para medir as interações TF-DNA por anisotropia de fluorescência, pegue uma placa de vários poços. Adicione gel fundido misturado com uma solução tamponada, contendo concentrações conhecidas de DNA de referência marcado com fluoróforo, compreendendo um local de ligação de TF e uma concentração mais alta de moléculas de TF, ao poço e incuba.
À medida que o DNA de referência marcado se distribui no gel, uma concentração mais alta da molécula de TF garante que todas as moléculas de DNA sejam ligadas ao TF. Adicione uma solução tamponada contendo DNA concorrente não rotulado com uma mutação de ponto único.
Analise o gel da placa usando microscopia de anisotropia de fluorescência de alto desempenho.
A luz polarizada excita o fluoróforo ligado ao DNA de referência, que se reorienta devido à queda molecular e emite luz despolarizada multidirecional - um fenômeno chamado anisotropia de fluorescência, FA.
Ao se ligar ao TF, o peso molecular do fluoróforo ligado ao DNA de referência aumenta e ele cai mais devagar, emitindo mais luz polarizada que aumenta o FA.
O DNA concorrent
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