Ensaio de repressão gênica repórter para estudar a regulação translacional de um gene alvo

As proteínas de ligação ao RNA, RBPs, funcionam como reguladores pós-transcricionais, ligando-se à região de iniciação da tradução, TIR, do mRNA e reprimindo a tradução.

Para estudar as interações RNA-RBP por meio da repressão translacional de um gene repórter, pegue uma cultura de células bacterianas contendo dois plasmídeos - o local de ligação e os plasmídeos RBP.

O plasmídeo do local de ligação codifica um gene repórter fluorescente. Após a transcrição, o TIR do mRNA resultante contém um sítio de ligação ao ribossomo e uma estrutura em grampo, com uma sequência reconhecida por RBPs.

Os ribossomos se ligam ao local de ligação no mRNA e desestabilizam a estrutura do grampo de cabelo, levando à tradução do mRNA e à formação de proteína repórter fluorescente. O plasmídeo RBP expressa um RBP quimérico fundido a uma proteína fluorescente diferente. Um promotor induzível controla a expressão da proteína quimérica.

Adicione o indutor, que ativa um fator de transcrição que se liga ao promotor, induzindo a expressão de proteínas quiméricas. A RBP da proteína quimérica se liga à estrutura do gancho de cabelo. Isso impede que o ribossomo se ligue ao mRNA, inibindo a tradução da proteína re