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As proteínas de ligação ao RNA, RBPs, funcionam como reguladores pós-transcricionais, ligando-se à região de iniciação da tradução, TIR, do mRNA e reprimindo a tradução.
Para estudar as interações RNA-RBP por meio da repressão translacional de um gene repórter, pegue uma cultura de células bacterianas contendo dois plasmídeos - o local de ligação e os plasmídeos RBP.
O plasmídeo do local de ligação codifica um gene repórter fluorescente. Após a transcrição, o TIR do mRNA resultante contém um sítio de ligação ao ribossomo e uma estrutura em grampo, com uma sequência reconhecida por RBPs.
Os ribossomos se ligam ao local de ligação no mRNA e desestabilizam a estrutura do grampo de cabelo, levando à tradução do mRNA e à formação de proteína repórter fluorescente. O plasmídeo RBP expressa um RBP quimérico fundido a uma proteína fluorescente diferente. Um promotor induzível controla a expressão da proteína quimérica.
Adicione o indutor, que ativa um fator de transcrição que se liga ao promotor, induzindo a expressão de proteínas quiméricas. A RBP da proteína quimérica se liga à estrutura do gancho de cabelo. Isso impede que o ribossomo se ligue ao mRNA, inibindo a tradução da proteína repórter.
Com o aumento da concentração do indutor, a produção de RBP aumenta, resultando em uma inibição competitiva mais forte da ligação ribossômica ao mRNA.
Meça os diferentes sinais de fluorescência das proteínas quiméricas e repórteres. Plotar os sinais, obtendo a curva dose-resposta.
Com o aumento mediado por indutor na produção de RBP, a repressão translacional reduz a concentração da proteína repórter, confirmando a interação RNA-RBP.
Transformar os plasmídeos preparados em células bacterianas quimicamente competentes que já contenham um plasmídeo RBP-mCerúleo. Para economizar tempo, coloque as células em placas usando um pipetador de 8 canais em placas de 8 pistas contendo ágar Luria-Bertani com antibióticos relevantes. As colônias devem aparecer em 16 horas a 37 graus Celsius.
Selecione uma única colônia para cada transformante duplo e transfira para placas de 48 poços contendo 1,5 mililitros de LB com antibióticos apropriados. Cultive as células durante um período de 18 horas a 37 graus Celsius, agitando a 250 RPM. Armazene os estoques de glicerol durante a noite a -80 graus Celsius em placas de 96 poços.
De manhã, programe o robô para aquecer 180 microlitros de meio semi-pobre, ou SPM, em placas de 96 poços. Programe o robô para preparar a placa indutora.
Em uma placa limpa de 96 poços, prepare poços com SPM consistindo de 95% BA e 5% LB. O número de poços corresponde ao número desejado de concentrações de indutores. Adicione C4-HSL aos poços na placa indutora que conterá a maior concentração de indutor.
Em seguida, programe o robô para diluir em série o meio de cada um dos poços de maior concentração em 23 concentrações mais baixas, variando de 0 a 218 nanomolares. O volume de cada diluição do indutor deve ser suficiente para todas as tensões.
Para diluir as cepas durante a noite, programe o robô para diluir por um fator de 10, misturando 20 microlitros de bactérias com 180 microlitros de SPM em placas de 48 poços. Em seguida, dilua novamente por um fator de 10, retirando 20 microlitros da solução diluída para a placa de tensão pré-preparada adequada para medições fluorescentes.
Agora, programe o robô para adicionar o indutor diluído da placa indutora às placas de 96 poços com as deformações diluídas de acordo com as concentrações finais. Agite as placas de 96 poços a 37 graus Celsius por 6 horas. Durante esse tempo, faça medições da densidade óptica ou OD em 595 nanômetros, bem como mCherry e mCerulean fluorescência por meio de um leitor de placas a cada 30 minutos.
