JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 4:10 min • July 8th, 2025
Proteínas com atividade de RNA helicase podem ajudar a desenrolar e separar moléculas individuais de RNA em um duplex de RNA.
Para determinar a atividade helicase de uma proteína, pegue tubos contendo uma mistura de duplex de RNA marcado com biotina com uma saliência de 5', ATPs e armadilhas de RNA - fitas não marcadas complementares às fitas biotiniladas dos duplex.
Adicione a proteína com atividade helicase a cada tubo e incube por diferentes durações. A proteína se liga à saliência de 5' dos duplex.
Usando moléculas de ATP, ele quebra as ligações de hidrogênio entre duas fitas duplex, resultando em seu desenrolamento e liberação do RNA de fita simples biotinilado. As armadilhas de RNA interagem com as fitas marcadas com biotina, impedindo o recozimento com as fitas separadas.
Termine a reação usando um tampão de terminação.
Carregue as amostras em diferentes poços de um gel de poliacrilamida nativo. Execute a eletroforese. O RNA de fita simples de baixo peso molecular se move mais rápido do que os duplex de alto peso molecular. Essa mudança de mobilidade gera duas bandas distintas.
Seque o gel em uma membrana de náilon, transferindo os RNAs para a membrana. Após o blotting, exponha a membrana à luz UV, reticulando os RNAs na membrana.
Adicione estreptavidina conjugada com enzima quimioluminescente, que interage com a biotina nos duplex e fitas simples. Use substratos quimioluminescentes para produzir produtos de quimioluminescência.
Após a imagem, a intensidade da banda de baixo peso molecular aumenta com o tempo, correlacionando-se com a atividade helicase da proteína-alvo.
Para o ensaio de atividade de helicase MOV10, misture os reagentes de acordo com as instruções do manuscrito e adicione água para um volume de reação final de 20 microlitros. Incube a reação a 37 graus Celsius por 10 minutos, 30 minutos e 60 minutos e, em seguida, adicione 5X Stop Buffer para interromper a reação. Em seguida, prepare um gel de poliacrilamida nativa a 20% e carregue de 20 a 25 microlitros de cada amostra em cada poço. Execute o gel a 100 volts em um banho de gelo até que o marcador azul de bromofenol tenha migrado para o quarto inferior do gel.
A acrilamida é prejudicial e tóxica. É importante manuseá-lo com equipamento de proteção individual adequado.
Desmonte as placas de gel e apare o gel removendo os poços de carga e as pistas não utilizadas. Coloque o gel em tampão TBE 0,5X. Corte o papel de filtro e a membrana de náilon no tamanho do gel, pré-umedeça o papel e a membrana e monte a pilha para transferência.
Transferir as amostras do gel para a membrana num aparelho electroforético semi-seco a 90 miliamperes durante 20 minutos. Em seguida, reticule as amostras irradiando a membrana a 120 milijoules por centímetro quadrado por 45 a 60 segundos.
Para detecção de quimioluminescência, comece adicionando 20 mililitros de tampão de bloqueio à membrana e incubando-a por 15 a 30 minutos enquanto agita suavemente. Remova cuidadosamente o buffer de bloqueio e substitua-o pelo buffer de bloqueio conjugado. Incube a membrana novamente por 15 minutos.
Lave a membrana quatro vezes agitando por 5 minutos por lavagem. Em seguida, adicione 30 mililitros de tampão de equilíbrio de substrato à membrana e incube-a por 5 minutos agitando a 20 a 25 RPM.
Cubra toda a superfície da membrana com solução de trabalho de substrato e incube por 5 minutos. Após a incubação, escaneie a membrana em um sistema de imagem quimioluminescente por 1 a 3 segundos.