Medição da atividade helicase de uma proteína-alvo usando duplexes de RNA marcados com biotina

Proteínas com atividade de RNA helicase podem ajudar a desenrolar e separar moléculas individuais de RNA em um duplex de RNA.

Para determinar a atividade helicase de uma proteína, pegue tubos contendo uma mistura de duplex de RNA marcado com biotina com uma saliência de 5', ATPs e armadilhas de RNA - fitas não marcadas complementares às fitas biotiniladas dos duplex.

Adicione a proteína com atividade helicase a cada tubo e incube por diferentes durações. A proteína se liga à saliência de 5' dos duplex.

Usando moléculas de ATP, ele quebra as ligações de hidrogênio entre duas fitas duplex, resultando em seu desenrolamento e liberação do RNA de fita simples biotinilado. As armadilhas de RNA interagem com as fitas marcadas com biotina, impedindo o recozimento com as fitas separadas.

Termine a reação usando um tampão de terminação.

Carregue as amostras em diferentes poços de um gel de poliacrilamida nativo. Execute a eletroforese. O RNA de fita simples de baixo peso molecular se move mais rápido do que os duplex de alto peso molecular. Essa mudança de mobilidade gera duas bandas distintas.

Seque o gel em uma membrana de náilon, transferindo os RNAs para a membrana. Após o blotting, expo