Ensaio pull-down de proteína de RNA para isolar proteínas de ligação a RNA por meio de extração de afinidade

Para isolar proteínas de ligação ao RNA, ou RBPs - reguladores pós-transcricionais - suspenda pequenas sondas de RNA contendo um elemento rico em adenilato-uridilato, ou ARE - uma sequência reconhecida pelos RBPs alvo. As sondas de RNA são marcadas com destiobiestina - um derivado da biotina.

Adicione esferas magnéticas revestidas com estreptavidina - uma proteína com afinidade pela biotina. Incube sob agitação para evitar que as contas assentem. O RNA marcado com destiobiotina liga-se à estreptavidina, imobilizando assim o RNA nas contas.

Sob o campo magnético, as contas se acumulam na lateral do tubo. Remova o sobrenadante. Ressuspenda os grânulos em um tampão, fornecendo um pH ideal para a ligação RBP-RNA.

Após a exposição ao ímã, as contas se acumulam na lateral do tubo. Descarte o sobrenadante. Ressuspender os grânulos numa solução contendo os RBP alvo e incubar sob agitação.

Os RBPs alvo possuem motivos de reconhecimento de RNA que reconhecem a sequência ARE e se ligam ao RNA, formando assim um complexo RNA-proteína imobilizado nas contas.

Sob o campo magnético, as esferas se movem em direção ao ímã sem perturbar as interações proteína-RNA. Descarte o sobrenadante. Ressuspend