Termoforese em microescala para estudar interações proteína-lipídio em solução

Para estudar a interação de proteínas com moléculas lipídicas, comece com dois tubos capilares. Adicione proteínas de teste marcadas com corante fluorescente em ambos os tubos e moléculas lipídicas não marcadas a um deles. Coloque esses capilares em uma matriz e coloque-os dentro de um instrumento de termoforese em microescala.

Irradie o capilar contendo proteínas com luz infravermelha focalizada, criando um aumento de temperatura no ponto focal que se difunde através da solução, gerando um gradiente de temperatura dentro de uma região estreita contendo proteínas marcadas com fluorescência.

O detector de fluorescência coleta o sinal de fluorescência do mesmo ponto do capilar - onde o laser está focado. O processador converte o sinal e gera um gráfico da fluorescência relativa em função do tempo.

Em um gradiente de temperatura, as proteínas marcadas começam a migrar da região mais quente para a região mais fria, exibindo termoforese - um fenômeno de migração dependente da temperatura.

Devido à termoforese, a intensidade da fluorescência diminui gradualmente ao longo do tempo e atinge um estado estacionário, onde as proteínas marcadas atingem o equilíbrio.

Irradie o capilar contendo mistura de proteínas-lipídios, criando um gradiente de temperatura.

Durante a termoforese, as proteínas migratórias marcadas interagem com as moléculas lipídicas, formando complexos lipídico-proteicos com massas moleculares mais altas. Isso leva ao retardo de seus movimentos.

Essa migração diferencial causa uma mudança na fluorescência, confirmando a interação proteína-lipídio bem-sucedida.

Antes de iniciar uma análise, ligue o botão liga/desliga na parte traseira do dispositivo MST e abra o software de controle. Confirme se o computador está conectado ao dispositivo e no status "Conectado" e defina o MST Antes para 3 segundos, o MST para 30 segundos e a Recuperação de Fluorescência para após 1 segundo.

Para cada tubo capilar, insira o nome do ligante alvo, o nome do analito do ligante, a concentração do alvo e a concentração de titulação mais alta usando a taxa de titulação de preenchimento automático. Selecione um intervalo de potências MST e insira os valores de cada potência para testar o ajuste de associação mais robusto.

Para preparar amostras de MST marcadas, dilua uma solução de Vam7-octahistidina a uma concentração de 200 nanomolares e um corante NTA-Atto 647 a uma concentração de 100 nanomolares, ambos em PBS. Misturar a Vam7-octahistidina e o corante NTA-Atto 647 numa proporção volumétrica de 1 para 1 e deixar a mistura repousar à temperatura ambiente, protegida da luz, durante 30 minutos. No final da incubação, centrifugue a mistura de corante e proteína e armazene a solução a 4 graus Celsius por até algumas horas antes de usar. Em seguida, prepare a amostra. Pegue o corante para o ligante e exponha o analito.

Para a termoforese MicroScale da amostra, abra o dispositivo e deslize o rack capilar para fora. Carregue os capilares de amostra no rack com a maior concentração na posição 1 e selecione o canal vermelho no software de controle. Em seguida, carregue o rack no instrumento. Em seguida, selecione uma faixa de potência MST e inicie a medição Cap Scan + MST e avalie a resposta de deslocamento.