Citometria de fluxo quantitativa para estudar interações proteína-fosfolipídio veicular marcadas

As interações proteína-fosfolipídio na membrana celular são cruciais para a regulação de diversos processos celulares.

Para detectar interações proteína-fosfolipídio alvo in vitro usando citometria de fluxo quantitativa, pegue um tubo contendo uma concentração desejada de imitação de membrana celular - vesículas fosfolipídicas marcadas com corante lipofílico de tamanho mícron - em tampão.

Adicione uma concentração apropriada de diferentes proteínas-alvo marcadas com fluorescência em solução.

Injectar a suspensão no citómetro de fluxo. Defina os parâmetros do sistema fluídico para uma taxa de fluxo baixa para permitir tempo suficiente para as interações proteína-fosfolipídio.

À medida que as proteínas marcadas com fluorescência e as vesículas fosfolipídicas interagem no canal de fluxo, a concentração de proteínas ligadas às vesículas aumenta.

À medida que esses complexos passam pelos feixes de laser de canais de fluorescência específicos que fornecem comprimentos de onda apropriados, eles ficam excitados. Essas proteínas excitadas e vesículas fosfolipídicas no complexo emitem os respectivos sinais de fluorescência após o relaxamento para o estado fundamental, que são capturados pelos detectores apropriados.

A detecção de uma alta intensidade média de fluorescência das proteínas é indicativa de ligação de proteínas às vesículas fosfolipídicas.

Inicie os experimentos de ligação cinética diluindo as vesículas fosfolipídicas no tampão de Tyrode até uma concentração de 1 micromolar e um volume total de 250 microlitros. Em seguida, misture o fator de coagulação X ou fX-fd marcado com fluorescência a uma concentração de 500 nanomolares com as vesículas fosfolipídicas na proporção de 1:1 para obter um volume total de 500 microlitros.

Injetar imediatamente 500 microlitros da suspensão mista no citômetro de fluxo a uma taxa de fluxo com um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros e um filtro de emissão de 585 nanômetros com uma largura de 42 para o canal FL2.

Em seguida, meça a fluorescência média no canal FL4 com excitação em 633 nanômetros e filtro de emissão em 660 nanômetros com largura de 20. Quando a saturação da ligação for alcançada, dilua rapidamente a amostra 20 vezes com o tampão de Tyrode e monitore a dissociação até que uma fluorescência de linha de base ou um platô seja alcançado.