Técnica de Microgravimetria Dissipativa para Estudo da Interação Proteína-Bicamada Lipídica

Para estudar a interação entre uma proteína de ligação a fosfolipídios e uma bicamada lipídica por meio de microgravimetria dissipativa, faça uma microbalança com um sensor de quartzo. Ao aplicar uma tensão adequada, a camada de quartzo - imprensada entre dois eletrodos de metal - oscila em uma frequência específica.

Adicione uma suspensão de pequenas vesículas unilamelares - consistindo de uma única bicamada lipídica - no sensor. As vesículas adsorvem na superfície hidrofílica revestida de sílica - aumentando a massa do sensor e diminuindo proporcionalmente sua frequência de oscilação.

As vesículas preenchidas com tampão atuam como uma camada viscoelástica, levando à dissipação - o amortecimento da oscilação. As vesículas adsorvidas se rompem, liberando o tampão fechado. A diminuição resultante da massa aumenta a frequência de oscilação.

As vesículas rompidas formam uma bicamada contínua, imitando uma membrana biológica. A rigidez da bicamada diminui a dissipação.

Adicione um tampão contendo íons de cálcio, junto com a proteína alvo. Os íons de cálcio se ligam à proteína e alteram sua conformação - permitindo a ligação às moléculas lipídicas na bicamada.

A ligação às proteínas aumenta a massa do sensor - levando a uma frequência diminuída. A integridade estrutural da bicamada permanece inalterada - causando apenas um ligeiro aumento na dissipação.

Adicione um agente quelante para quelar os íons de cálcio - dissociando as proteínas da bicamada.

A ausência de proteínas ligadas retorna a frequência e a dissipação da oscilação aos níveis não ligados à proteína - confirmando que a ligação é exclusivamente dependente do cálcio e que a bicamada permanece intacta.

Encaixe cuidadosamente os sensores limpos de plasma nas quatro câmaras de fluxo usando uma pinça. Evite qualquer pressão ou torção nas câmaras e tubos que possam causar vazamentos. Lave o sistema com tampão de citrato no modo de fluxo aberto por 10 minutos.

Inicie o programa. Comece a gravar quaisquer alterações na frequência e dissipação do primeiro tom fundamental e harmônicos usando o software até que as linhas de base de frequência e dissipação estejam estáveis.

Quando as linhas de base estiverem estáveis, aplique a suspensão SUV no tampão de citrato. Usando um recipiente de reação, remova 1,5 mililitros do volume morto. Em seguida, feche o sistema no modo de fluxo de loop. Registre a mudança de dissipação de frequência por mais 10 minutos.

Quando o SLB estiver estável, equilibre o sistema com o tampão de corrida nas concentrações de cálcio necessárias em um modo de fluxo aberto por 40 minutos. Adicione a proteína ao tampão de corrida contendo cálcio. Efectuar a aplicação da proteína em modo loop-flow até se atingir um estado estacionário de equilíbrio.