Ensaio de modulação de pH em bicamadas lipídicas suportadas para detectar interações proteína-fosfoinositídeo

O fosfatidilinositol 4,5-bifosfato, ou PIP2, é um fosfolipídio fosforilado ligado à membrana. A fosfolipase C, ou PLC, com domínios específicos de ligação a PIP2, liga-se a PIP2, gerando mensageiros secundários essenciais para vários processos celulares.

Para detectar interações PLC-PIP2 in vitro, comece com uma pequena vesícula unilamelar, SUV, suspensão ácida, compreendendo PIP2 e mistura de fosfolipídios, um dos quais é conjugado a um corante fluorescente sensível ao pH.

Pipete a solução na entrada de um dispositivo microfluídico fabricado pré-montado e conecte a tubulação de saída. Transfira e prenda o dispositivo em um microscópio de fluorescência stage. Através da gravidade, os SUVs passam pelo piso de microcanais, feito de uma lamínula de vidro hidrofílico.

Os SUVs adsorvem na superfície do vidro, o pH da solução reduzindo a repulsão eletrostática entre os dois. Os SUVs interagem com a superfície, deformando-se e fundindo-se para formar grandes vesículas.

Após a cobertura crítica da superfície, as vesículas se rompem espontaneamente, formando uma bicamada lipídica suportada, SLB. Passe um tampão pelo canal, removendo as vesículas não adsorvidas.

Usando um canal de fluorescên