Ensaio de modulação de pH em bicamadas lipídicas suportadas para detectar interações proteína-fosfoinositídeo

O fosfatidilinositol 4,5-bifosfato, ou PIP2, é um fosfolipídio fosforilado ligado à membrana. A fosfolipase C, ou PLC, com domínios específicos de ligação a PIP2, liga-se a PIP2, gerando mensageiros secundários essenciais para vários processos celulares.

Para detectar interações PLC-PIP2 in vitro, comece com uma pequena vesícula unilamelar, SUV, suspensão ácida, compreendendo PIP2 e mistura de fosfolipídios, um dos quais é conjugado a um corante fluorescente sensível ao pH.

Pipete a solução na entrada de um dispositivo microfluídico fabricado pré-montado e conecte a tubulação de saída. Transfira e prenda o dispositivo em um microscópio de fluorescência stage. Através da gravidade, os SUVs passam pelo piso de microcanais, feito de uma lamínula de vidro hidrofílico.

Os SUVs adsorvem na superfície do vidro, o pH da solução reduzindo a repulsão eletrostática entre os dois. Os SUVs interagem com a superfície, deformando-se e fundindo-se para formar grandes vesículas.

Após a cobertura crítica da superfície, as vesículas se rompem espontaneamente, formando uma bicamada lipídica suportada, SLB. Passe um tampão pelo canal, removendo as vesículas não adsorvidas.

Usando um canal de fluorescência adequado, crie imagens do microcanal para visualizar e medir a fluorescência do corante sensível ao pH - altamente fluorescente em pH baixo - no SLB.

Introduza uma solução PLC recombinante no microcanal. O pH neutro da solução, abaixo do ponto isoelétrico do CLP, faz com que o CLP seja carregado positivamente.

O PLC recombinante, com seu domínio de ligação PIP2, liga-se ao PIP2, recrutando íons hidróxido carregados negativamente para a superfície da bicamada. Isso torna a superfície da bicamada mais básica, mudando o estado de protonação do corante e causando extinção de fluorescência, indicando interações PLC-PIP2.

Transfira 100 microlitros do fosfatidilinositol-4 5-bifosfato contendo pequenas vesículas unilamelares para um tubo de microcentrífuga de 0,65 mililitro. Ajuste o pH da solução para aproximadamente 3,2 adicionando 6,4 microlitros de ácido clorídrico 0,2 normal.

Pipete 10 microlitros da solução de vesícula unilamelar pequena com pH ajustado em cada canal através da entrada e aplique pressão através da pipeta até que a solução atinja a saída. Retire a ponta da pipeta e deixe-a presa ao dispositivo. Depois de repetir esta etapa para cada canal, incube o dispositivo por 10 minutos em temperatura ambiente.

A injeção de vesículas em microcanais deve ser realizada imediatamente após a montagem do dispositivo. Enquanto isso, corte conjuntos de tubos de entrada e saída. Usando uma pinça, conecte o conjunto de tubos de saída ao dispositivo e, em seguida, prenda o dispositivo em um microscópio stage.

Mergulhe uma extremidade do conjunto de tubos de entrada em 25 mililitros de buffer de corrida contido em um tubo cônico e prenda-o com fita adesiva para garantir que o tubo esteja preso. Usando um conector de laboratório, coloque o tubo cônico em um terreno mais alto do que o dispositivo para empurrar a solução através dos microcanais por meio do fluxo de gravidade.

Para cada tubo de entrada, use uma seringa para extrair 1 mililitro de tampão de corrida da extremidade livre do tubo. Remova a ponta da pipeta da entrada e insira a extremidade livre do tubo de entrada no dispositivo. Repita este processo para conectar todas as peças da tubulação de entrada ao dispositivo. O fluxo do tampão de corrida através dos canais ajuda a remover o excesso de vesículas não rompidas e equilibrar a bicamada em condições experimentais.

Em seguida, abra o software de controle do microscópio. No painel esquerdo, clique na guia "Microscópio" e escolha a objetiva "10x". Clique em "Ao vivo" e, em seguida, nos ícones de imagem "Alexa 568" na barra de ferramentas. Usando os botões de ajuste Fino e Grosso, concentre-se nos microcanais. Examine o dispositivo para verificar a qualidade dos SLBs e dos canais.

Em seguida, clique no ícone de imagem "FL Shutter Closed" na barra de ferramentas. Clique na guia "Aquisição" e, em "Ajustes básicos", selecione o tempo de exposição. Defina o tempo de exposição para 200 milissegundos. No painel esquerdo, clique em "Multidimensional Acquisition". No menu "Filtros", selecione o canal vermelho. Em seguida, clique no menu "Time-lapse". Defina o intervalo de tempo para 5 minutos, a duração para 30 minutos e o menu de lapso.

Selecione a ferramenta "Círculo" na guia "Medir" e desenhe um círculo em qualquer canal. Clique com o botão direito do mouse enquanto o círculo estiver selecionado e escolha "Propriedades". Na guia "Perfil", marque "todos os T" para visualizar a intensidade da fluorescência em função do tempo. Certifique-se de que essa curva atinja um platô, que indica equilíbrio, antes de prosseguir para a próxima etapa.

Abaixe a solução tampão para um aterramento igual ao do dispositivo para interromper o fluxo. Um de cada vez, retire cada tubo de saída e aplique 200 microlitros de cada diluição de proteína no canal de saída usando uma pipeta. Não aplique nenhuma pressão. Deixe a gravidade fazer o trabalho. Retire a ponta da pipeta e deixe-a presa ao dispositivo microfluídico. Repita esse processo para cada canal e certifique-se de que bolhas de ar não sejam introduzidas nos canais durante esse processo.

Em seguida, abaixe o tubo de entrada para um solo abaixo do dispositivo microfluídico para começar a fluir a proteína através dos microcanais. Cole a extremidade livre do tubo em um recipiente de resíduos. Fluir as diluições do domínio de homologia de Pleckstrin por 30 minutos. No painel esquerdo do software, na guia "Time-Lapse", clique em "Iniciar" para iniciar a imagem novamente.