Cromatografia de exclusão de tamanho com espalhamento de luz multiangular para oligômeros de proteínas

Um oligômero de proteína é um complexo de várias subunidades de proteína que são unidas para formar uma unidade funcional maior.

Para determinar o peso molecular dos monômeros de proteínas e seus oligômeros em solução por SEC-MALS, uma combinação de cromatografia de exclusão de tamanho e espalhamento de luz multiangular, comece com uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho, ou SEC.

A coluna contém esferas de gel esféricas porosas semelhantes a peneiras que prendem moléculas de tamanho menor dentro delas. Equilibre a coluna com um tampão compatível com o estado nativo da proteína.

Colocar uma amostra contendo monómeros e oligômeros de proteínas no topo da coluna.

Durante o fluxo, os oligômeros passam pelo espaço interpartícula da coluna, enquanto os monômeros ficam presos nos poros dos grânulos. Isso faz com que os oligômeros de proteínas de tamanho maior viajem mais rápido do que os monômeros de tamanho menor.

Direcione os oligômeros de eluição rápida, seguidos pelos monômeros de eluição lenta, para o detector MALS.

À medida que passam pelo detector, uma luz laser os ilumina, que se espalha em diferentes ângulos. Os oligômeros de múltiplas subunidades espalham mais luz do que o monômero.

A intensidade da luz espalhada em vários ângulos é diretamente proporcional ao peso molecular do oligômero e monômero da proteína.

Inicie este procedimento com a preparação do sistema SEC-MALS conforme descrito no protocolo de texto. Usando reagentes de grau HPLC, prepare um litro de solução salina tamponada com fosfato com 50 a 100 mililitros de cloreto de sódio. Filtre o tampão a 0,1 mícron usando um filtro de poliéter sulfona ou similar.

Filtre os primeiros 50 a 100 mililitros de tampão para um frasco de resíduos para eliminar as partículas dos filtros secos. Em seguida, filtre o restante para uma garrafa limpa e estéril que tenha sido previamente lavada com água deionizada filtrada e guardada para evitar a entrada de poeira.

Lave a coluna durante a noite a uma vazão de 0,5 mililitros por minuto para equilibrar a coluna no buffer e remover partículas. Use o modo "Fluxo contínuo" do FPLC e certifique-se de que o fluxo não pare até que todas as execuções SEC-MALS sejam concluídas. Coloque a célula de fluxo dRI no modo de purga durante a descarga noturna.

Ao iniciar a descarga, aumente gradualmente a vazão para evitar o efeito de "derramamento da coluna" causado por uma mudança repentina de pressão na coluna. Desligue a limpeza antes de iniciar as execuções de amostra.

Verifique a limpeza do sistema batendo levemente na tubulação a jusante da coluna para liberar as partículas acumuladas. Observe o sinal no detector de 90 graus no visor do painel frontal do instrumento MALS. Verifique se o ruído pico a pico não é superior a 50 a 100 microvolts. Além disso, verifique se o índice de refração ou o sinal RI está estável em menos de 1 x ^{10-7 unidades de} índice de refração.

Execute uma injeção 'em branco' para verificar se o injetor está livre de partículas. Um 'branco' é simplesmente o tampão de corrida preparado em um frasco estéril fresco. Se o pico de partículas não for superior a 1 mililitro de volume e não superior a 5 milivolts acima da linha de base, o sistema estará pronto para amostras. Caso contrário, execute injeções adicionais em branco até limpar ou faça manutenção para limpar o injetor.

Agora, prepare pelo menos 200 microlitros de BSA a 1 a 2 miligramas por mililitro no tampão SEC. Filtre a proteína a 0,025 mícrons usando um filtro de ponta de seringa. Descarte as primeiras gotas de filtrado para eliminar as partículas dos filtros secos. Como alternativa, centrifugue a amostra a 10.000 vezes g por 15 minutos para permitir a precipitação de agregados não solúveis e outras partículas grandes. Em seguida, injete 100 microlitros da solução BSA no circuito.