Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 7:16 min. • July 8th, 2025
A calorimetria exploratória diferencial ajuda a estudar as interações biomolécula-ligante, medindo o calor necessário para desnaturar a biomolécula na ausência e presença do ligante.
Para começar, pegue uma referência contendo aptâmeros de DNA livre - oligonucleotídeos de fita simples estruturados - e uma amostra contendo aptâmeros ligados a ligantes termolábeis. Os ligantes estabilizam a estrutura secundária do aptâmero.
Execute uma varredura direta aquecendo as soluções. Ao atingir a temperatura de fusão, os aptâmeros livres desnaturam.
Os aptâmeros estabilizados por ligantes se dissociam dos ligantes e desnaturam a uma temperatura relativamente mais alta, causando um aumento na temperatura de fusão em comparação com os aptâmeros livres. Em altas temperaturas, um subconjunto de ligantes obtém uma forma secundária irreversível com baixa afinidade de ligação.
Em seguida, execute uma varredura reversa resfriando as soluções para recuperar a estrutura do aptâmero. Na temperatura mais baixa, os ligantes inicial e convertido na amostra se ligam aos aptâmeros.
Durante a segunda varredura direta, os aptâmeros ligados com uma afinidade fraca aos ligantes convertidos se dissociam e desnaturam a uma temperatura mais baixa do que os aptâmeros ligados ao ligante inicial, causando uma redução na temperatura de fusão.
Com varreduras sucessivas, os ligantes continuam a se converter para a forma secundária, resultando na depleção completa da forma inicial. Obtenha o termograma.
A cada varredura, a temperatura de fusão do aptâmero ligado ao ligante muda em direção ao aptâmero livre, indicando a fraca afinidade de ligação da forma secundária.
Desgaseifique as soluções de tampão, biomolécula e ligante em um desgaseificador de mesa antes de carregá-lo no calorímetro de varredura diferencial, ou DSC. Desaperte a alavanca de pressão do DSC. Em seguida, passe o tubo de silicone do tampão de trabalho e prenda-o ao flange frontal do capilar de referência.
Crie uma ponte entre os capilares de referência e de amostra conectando o flange de referência traseiro ao flange de amostra frontal. Em seguida, conecte um pedaço de tubo de silicone ao flange de amostra traseiro que corre para um frasco de resíduos com uma linha de vácuo conectada. Ligue a linha de vácuo para lavar o DSC com 200 mililitros de buffer de trabalho.
Comece conectando seções de cerca de 3 a 5 centímetros de tubo de silicone aos flanges capilares de referência. Em seguida, insira uma ponta de pipeta de 1 mililitro no tubo de silicone do flange traseiro. Retire 0,8 mililitros de tampão de trabalho com uma pipeta e insira a ponta da pipeta com tampão no tubo de silicone do flange de referência frontal.
Pressione suavemente o êmbolo da pipeta para baixo para passar o tampão de trabalho através do tubo de silicone frontal para o capilar de referência e para cima na ponta da pipeta anexada do flange traseiro. Pressione o êmbolo da pipeta para baixo até que o nível do tampão de trabalho atinja logo acima do tubo de silicone frontal. Em seguida, solte o êmbolo da pipeta até que o nível do tampão de trabalho atinja logo acima do tubo de silicone traseiro. Continue passando o buffer de trabalho para frente e para trás no capilar de referência para purgar o volume das bolhas.
Em seguida, tampe a ponta da pipeta traseira com o dedo indicador e puxe suavemente a ponta da pipeta traseira e a pipeta frontal para removê-las dos flanges de referência com o tubo de silicone conectado. Carregue o capilar da amostra com tampão de trabalho como antes.
Coloque uma tampa de plástico preta na referência traseira e sample flanges, deixando os flanges frontais descobertos. Conecte a alavanca de pressão ao DSC e, em seguida, abra o software DSC e pressurize o instrumento clicando na seta vermelha "Para cima" na parte superior da interface assim que a leitura de energia se estabilizar. A potência DSC é indicada em uma caixa no canto superior direito da interface, juntamente com a leitura da temperatura e pressão do instrumento.
Equilibre o DSC com o buffer de trabalho executando uma varredura direta e reversa. Na guia "Método experimental" no lado esquerdo da tela, certifique-se de que a opção "Digitalização" esteja selecionada para executar o DSC no modo de varredura de temperatura.
Na inserção "Parâmetros de temperatura" na guia "Método experimental", clique no botão para aquecimento. Insira 1 e 100 graus Celsius para as temperaturas experimentais inferior e superior, 1 grau Celsius por minuto para a taxa de varredura e 60 segundos para o período de equilíbrio. Clique no botão "Adicionar série" no campo de entrada para o período de equilíbrio. Digite 2 no campo "Etapas para adicionar" na janela pop-up e marque a caixa "Aquecimento/resfriamento alternativo". Clique em "OK".
As varreduras adicionadas aparecem na parte inferior da interface. Verifique se os parâmetros de cada varredura são os desejados. Inicie o experimento clicando no botão verde "Reproduzir" na parte superior da interface. Navegue até a janela desejada e insira um nome de arquivo para salvar o experimento na janela pop-up. Visualize o progresso do experimento clicando na guia "Dados" à direita da guia "Método do experimento".
Execute experimentos de referência para subtração de linha de base dos dados da amostra recarregando o DSC com buffer de trabalho em ambos os capilares. Colete várias varreduras diretas e reversas em uma faixa de temperatura adequada a 1 grau Celsius por minuto com um tempo de equilíbrio superior de 120 segundos.
Exclua as verificações de equilíbrio de buffer anteriores da parte inferior da interface destacando cada uma individualmente e clicando no "X" vermelho no meio direito da interface.
Adicione as novas digitalizações clicando no botão "Adicionar série", digitando 20 no campo "Etapas para adicionar" e marcando a caixa "Aquecimento/resfriamento alternativo". Em seguida, clique em "OK" e execute o experimento clicando no botão verde "Reproduzir" como antes.
Repita essas etapas com o tampão de trabalho contendo a concentração desejada de ligante em ambos os capilares para obter os experimentos de referência para o ligante. Colete dois experimentos separados para serem usados na aquisição da constante de taxa para conversão de ligantes termolábeis.
Para o conjunto de dados de biomolécula livre, certifique-se de que o capilar de referência contém o tampão de trabalho, enquanto o capilar da amostra contém a biomolécula livre na concentração desejada no tampão de trabalho. Em seguida, execute os experimentos de amostra usando o mesmo procedimento de carregamento de DSC e parâmetros experimentais usados nas varreduras de referência.
Para os experimentos ligados ao ligante, certifique-se de que o ligante esteja no tampão de trabalho no capilar de referência e que a biomolécula mais o ligante estejam no tampão de trabalho no capilar da amostra. Libere o sistema entre adições de diferentes ligantes como antes.
Realize um experimento adicional com a biomolécula ligada ao ligante termolábil, onde o período de equilíbrio de alta temperatura é aumentado para 600 segundos e todos os outros parâmetros experimentais são os mesmos de antes. Prossiga para o processamento e análise de dados conforme descrito no protocolo de texto.