Ensaio de ligação competitiva para identificar compostos que interrompem as interações receptor-ligante

O ensaio de ligação competitiva identifica pequenas moléculas que interrompem as interações receptor-ligante ligando-se competitivamente a um receptor-alvo, inibindo a ligação natural do ligante.

Para identificar as interações de um receptor com seu ligante natural na presença de um antagonista de pequena molécula específico do receptor, comece com uma suspensão de células de linfócitos T humanos expressando o receptor-alvo.

Adicione a suspensão celular aos poços de uma placa de vários poços contendo concentrações crescentes de antagonistas. Incubar. O antagonista se liga ao local de ligação ortostérico - o local natural de ligação ao ligante do receptor.

Adicione uma concentração fixa de ligantes naturais marcados com fluorescência aos poços. Incubar.

Em baixas concentrações, os antagonistas ocupam poucos sítios de ligação ortostéricos, permitindo a ligação natural do ligante aos receptores. No entanto, em concentrações mais altas, os antagonistas ocupam a maior parte dos locais de ligação ortostérica, permitindo uma ligação natural mínima do ligante-receptor.

Centrifugue para pellet as células. Descarte o sobrenadante. Ressuspender as células em paraformaldeído para fixá-las, pre