Ensaio de ligação competitiva para identificar compostos que interrompem as interações receptor-ligante

O ensaio de ligação competitiva identifica pequenas moléculas que interrompem as interações receptor-ligante ligando-se competitivamente a um receptor-alvo, inibindo a ligação natural do ligante.

Para identificar as interações de um receptor com seu ligante natural na presença de um antagonista de pequena molécula específico do receptor, comece com uma suspensão de células de linfócitos T humanos expressando o receptor-alvo.

Adicione a suspensão celular aos poços de uma placa de vários poços contendo concentrações crescentes de antagonistas. Incubar. O antagonista se liga ao local de ligação ortostérico - o local natural de ligação ao ligante do receptor.

Adicione uma concentração fixa de ligantes naturais marcados com fluorescência aos poços. Incubar.

Em baixas concentrações, os antagonistas ocupam poucos sítios de ligação ortostéricos, permitindo a ligação natural do ligante aos receptores. No entanto, em concentrações mais altas, os antagonistas ocupam a maior parte dos locais de ligação ortostérica, permitindo uma ligação natural mínima do ligante-receptor.

Centrifugue para pellet as células. Descarte o sobrenadante. Ressuspender as células em paraformaldeído para fixá-las, preservando a morfologia celular.

Usando um citômetro de fluxo, analise os sinais de fluorescência de linfócitos T individuais que expressam os receptores ligados ao antagonista e ao ligante fluorescente.

Uma diminuição dependente da dose na intensidade média de fluorescência com o aumento das concentrações de antagonistas específicos do receptor indica ligação competitiva dos antagonistas aos locais de ligação ao receptor ortostérico, inibindo a interação ligante-receptor natural.

Para começar, dispense 100 microlitros de solução composta em uma placa transparente de fundo redondo de 96 poços de acordo com um layout experimental predefinido.

Adicione 50 microlitros de suspensão celular de um reservatório de reagente na placa de 96 poços usando uma pipeta multicanal. Incube a placa por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro.

Após a incubação, adicione 50 microlitros de 100 nanogramas por mililitro CXCL12 marcados com fluorescência de um reservatório de reagente semelhante aos poços da placa de 96 poços. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro.

Em seguida, centrifugue a placa de 96 poços a 400 vezes a gravidade por 5 minutos em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante das células peletizadas virando a placa. Seque o prato em um lenço de papel. Adicione 200 microlitros de tampão de ensaio fresco de um reservatório de reagente aos poços usando uma pipeta multicanal.

Imediatamente centrifugar novamente a placa por 5 minutos a 400 vezes a gravidade à temperatura ambiente. Novamente, remova o sobrenadante virando a placa e, em seguida, secando-o em um lenço de papel. Finalmente, ressuspenda suavemente o pellet celular em 200 microlitros de paraformaldeído a 1% dissolvido em PBS. Esta etapa corrigirá as células.

Para analisar as amostras por citometria de fluxo, inicie o dispositivo e abra o software correspondente. Selecione os parâmetros celulares a serem visualizados em um formato de dot-blot como área de dispersão direta, área de dispersão lateral e, em uma visualização de histograma, o canal de detecção de fluoróforo.

Escolha uma amostra, por exemplo, uma amostra de controle negativo, para realizar o gating de uma população de células homogênea definida com base nos parâmetros de dispersão direta e lateral. Adaptar as regulações para carregar as células no dispositivo de citometria de fluxo.

Selecione três misturas antes da injeção. Selecione a injeção automática de 100 microlitros de células fixadas e use uma taxa de fluxo de amostra de 1,5 microlitros por segundo. Execute o exemplo selecionando "Adquirir dados". Os parâmetros de dispersão direta e lateral para esta amostra, bem como a detecção de fluoróforo, agora aparecerão na tela.

Agora, selecione a ferramenta de gating do software. Com base na visualização do gráfico de dispersão direta e lateral, pré-defina uma população de células homogênea e viável por gating. Selecione para analisar 20.000 "eventos" por amostra.

Isso significa que, para cada amostra, 20.000 células que se enquadram em uma porta predefinida serão eventualmente analisadas. A aquisição de dados continuará até que esse número de eventos seja atingido.

Inicie a corrida selecionando primeiro os poços a serem analisados. Em seguida, selecione "Executar poços".

O dispositivo de citometria de fluxo agora analisará essas amostras uma a uma, registrando a intensidade média de fluorescência para cada amostra, que corresponde ao sinal fluorescente médio das 20.000 células que se enquadram na porta predefinida.

Por fim, realize a análise dos dados conforme descrito no protocolo.