JoVE Encyclopedia of Experiments
Técnicas Biológicas
0 vistas • 3:35 min • July 8th, 2025
Para estudar as interações receptor-ligante, comece com uma placa de vários poços contendo meios com células-alvo expressando ligantes de teste em sua superfície.
Adicione células BW de camundongo projetadas - uma nova população de células B que expressa receptores quiméricos ligados à membrana. Os receptores quiméricos compreendem o domínio extracelular de um receptor específico fundido ao domínio transmembrana e de sinalização intracelular do receptor de células B.
Os ligantes nas células-alvo interagem com o domínio extracelular dos receptores quiméricos das células BW, causando a ativação do domínio de sinalização intracelular nas células BW. Isso desencadeia a sinalização a jusante e a produção de citocinas - moléculas repórter secretoras que são liberadas fora das células BW, aparecendo na mídia.
Centrifugue a placa. Transferir o sobrenadante contendo citocinas para uma placa ELISA pré-revestida com anticorpos anticitocinas. As citocinas interagem com as regiões Fab dos anticorpos, levando à sua imobilização na superfície da placa.
Trate a placa com uma solução de bloqueio para bloquear locais de ligação não específicos. Adicione anticorpos anticitocinas biotinilados, que interagem com citocinas pré-ligadas e formam complexos imunes.
Cubra a placa com uma solução de estreptavidina conjugada com enzimas. A estreptavidina se liga à biotina nos complexos imunológicos.
Trate a placa com um substrato. A interação enzima-substrato produz um produto colorido, conferindo a mesma cor à solução. A solução colorida confirma a presença de moléculas repórteres, indicando interação receptor-ligante bem-sucedida.
Use 50.000 células BW transfectadas com seus alvos desejados em um único poço de uma placa de 96 poços. Incube a placa por 48 horas. Em seguida, congele a placa a -20 graus Celsius.
Cubra uma placa ELISA com anticorpo anti-Mouse IL-2. Coloque 0,05% microgramas de anti-camundongo-IL-2 em um volume de 50 microlitros de PBS em cada poço. Incube a placa revestida durante a noite a 4 graus Celsius.
Use um breve período de incubação a 37 graus Celsius para descongelar as células BW congeladas que foram incubadas anteriormente com seus alvos. Em seguida, centrifugue a placa e transfira 100 microlitros do sobrenadante de cada poço para a placa ELISA pré-revestida e incube a 37 graus Celsius por 2 horas.
Depois disso, adicione biotina anti-camundongo-IL-2 à placa ELISA. Em seguida, após incubação e lavagem, adicione estreptavidina conjugada com HRP à placa. Após incubação e lavagem, adicione 100 microlitros da solução de substrato TMB a cada poço da placa ELISA. Finalmente, leia a placa ELISA em 650 nanômetros.