Sonda de força de biomembrana para quantificar as interações receptor-ligante

A interação entre um receptor de célula T, TCR, e um peptídeo antigênico apresentado pelo MHC, ou complexo principal de histocompatibilidade, em uma célula apresentadora de antígeno, APC, faz com que a célula T exerça uma força mecânica sobre o APC. Este fenômeno é necessário para a ativação das células T.

Para quantificar as interações receptor-ligante usando uma sonda de força de biomembrana, BFP, comece com uma câmara celular personalizada baseada em lâminas. Coloque a câmara celular sob um microscópio.

Injete suspensões de hemácias inchadas biotiniladas, esferas de vidro de sonda revestidas com complexos MHC-estreptavidina-biotina ligados a peptídeos e células T na câmara. Posicione a sonda, o alvo e as micropipetas cheias de tampão auxiliares ao redor da câmara.

Aspirar um eritrócitos biotinilado com a pipeta de sonda, posicionando-o numa área em branco. Aspire uma célula T com a micropipeta alvo, posicionando-a à direita das hemácias. Aspire um cordão de sonda com a micropipeta auxiliar e conecte-o ao ápice das hemácias. A estreptavidina do grânulo se liga à biotina do RBC e forma uma sonda de força.

Alinhe a célula T com a sonda de força para permitir que o TCR interaja com seu ligante - o peptídeo ligado ao MHC - e a célula T exerça força sobre as hemácias. Retraia a célula T para quebrar a ligação TCR-peptídeo, que deforma as hemácias e desloca o cordão.

Meça a força necessária para quebrar a ligação - uma ligação mais forte precisa de uma força maior e mais tempo para quebrar, indicando uma vida útil mais longa.

Para iniciar o experimento BFP, ligue o microscópio e a fonte de luz. Coloque a câmara no microscópio principalstage O próximo passo é instalar todas as três micropipetas do BFP. A sonda à esquerda é para pegar um RBC. O alvo à direita é agarrar a célula, e o ajudante no canto inferior direito serve para pegar uma conta.

Para instalar, use um microinjetor para preencher uma micropipeta com tampão experimental. Retire a micropipeta do porta-pipetas e segure-a em um local mais baixo para permitir que o líquido escorra da ponta. Rapidamente, insira a micropipeta na ponta do suporte, certificando-se de que nenhuma microbolha de ar entre na micropipeta durante a inserção.

Aperte o parafuso do suporte e, em seguida, monte cada porta-pipeta em seu micromanipulador correspondente. Empurre a micropipeta em direção à câmara para que suas pontas entrem na área tampão da câmara. Ajuste a posição da micropipeta e encontre-a sob o campo de visão do microscópio.

Mova-se pelo palco do titular da câmara para encontrar as colônias dos três elementos, uma a uma. Ajuste a posição da micropipeta correspondente girando os botões dos manipuladores para permitir que a ponta da micropipeta se aproxime de uma célula ou cordão. Aspire a célula ou o grânulo ajustando a pressão dentro da micropipeta correspondente. Todas as três micropipetas capturarão seus elementos correspondentes.

Percorra o palco do suporte da câmara para encontrar um espaço aberto longe das colónias dos elementos injetados onde a experiência será realizada.

Mude o modo visual do microscópio para visualizar a imagem no programa de computador. Mova todos os três elementos nas pontas da pipeta para o campo de visão do programa. Em seguida, alinhe o cordão da sonda e as hemácias e manobre cuidadosamente o cordão da sonda até o ápice da hemácia. Agora, impinga brevemente o cordão no RBC e retraia suavemente.

Ajuste a pressão da micropipeta auxiliar para soprar suavemente o cordão para que fique colado no ápice das hemácias. Afaste a micropipeta auxiliar e alinhe o alvo e o cordão da sonda.

No programa, na janela Campo de visão, use as ferramentas do programa para medir os respectivos raios da micropipeta da sonda, as hemácias e a área de contato circular entre as hemácias e o cordão da sonda. Esses valores permitem estimar a constante de mola da hemácia pela equação listada no protocolo de texto.

Depois de inserir a constante de mola RBC desejada no programa, desenhe uma linha horizontal no ápice RBC que produzirá uma curva na janela adjacente indicando o brilho de cada pixel ao longo desta linha. Arraste a linha de limite para ficar em torno da metade da profundidade da curva.

Em seguida, selecione o modo de experimento desejado. Defina os parâmetros conforme desejado. Clique em Iniciar, o que permite que o programa mova a pipeta alvo e conduza o alvo para dentro e para fora do contato com a sonda.

A coleta de dados será realizada em paralelo, registrando a posição do cordão da sonda em tempo real. Pare o programa clicando no botão Pare de experimentar, momento em que uma janela aparecerá para permitir salvar os dados adquiridos.