Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 4:05 min. • July 8th, 2025
As proteínas de ligação ao nucleotídeo de guanina - uma categoria de GTPases - funcionam como um interruptor molecular, alternando entre uma forma ativa ligada ao GTP e uma forma inativa ligada ao GDP.
As GTPases ativas se ligam a parceiros proteicos específicos. Esses parceiros competem pelo mesmo local de ligação nas GTPases.
Para estudar a ligação competitiva, comece tomando uma suspensão de GTPase ligada ao GTP imobilizada em esferas magnéticas. Adicione o primeiro parceiro de interação - proteína A marcada com fluorescência. Incube sob agitação para manter as esferas em suspensão. A proteína A se liga e satura os locais de ligação em todas as moléculas de GTPase.
Divida esta solução igualmente em vários tubos. Adicione um segundo parceiro de interação - proteína B marcada com fluorescência - aos tubos em quantidades crescentes. Incubar sob agitação.
A proteína B se liga ao mesmo local de ligação nas GTPases - deslocando competitivamente a proteína A.
Exponha os tubos a um campo magnético para coletar as contas de um lado. Descarte o sobrenadante para remover as proteínas não ligadas. Ressuspenda as esferas complexadas com proteínas em um tampão adequado e quantifique as proteí
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