Ensaio de microarranjo de antígeno viral para detectar isotipos de anticorpos no soro contra o antígeno viral

Comece o ensaio de microarray de antígeno viral com uma lâmina de microarray de antígeno viral preparada.

O slide contém várias almofadas, cada uma com uma única matriz contendo centenas de antígenos purificados de várias cepas virais impressas em pontos dispostos em uma grade. Cada ponto contém um único tipo de antígeno adsorvido na superfície tridimensional da nitrocelulose microporosa.

Prenda a corrediça em uma câmara para facilitar o manuseio durante as etapas subsequentes. Adicione um tampão de bloqueio contendo proteínas que se ligam às superfícies restantes da lâmina para evitar a ligação não específica de anticorpos à superfície.

Incube a lâmina de microarray com soro humano diluído. Os isotipos de anticorpos no soro, específicos para os antígenos na lâmina, reconhecem e se ligam aos epítopos dos antígenos.

Remova o soro. Lave com um tampão para remover anticorpos e proteínas não ligados na lâmina.

Adicione misturas de anticorpos secundários conjugados com pontos quânticos, cada um com um ponto quântico diferente. Os anticorpos secundários específicos do isótipo ligam-se especificamente ao respectivo isotipo de anticorpos séricos ligados aos antigénios na lâmina.

Use um gerador de imagens de microarray para quantificar a ligação de anticorpos a antígenos dentro da lâmina de microarray.

Após a excitação em comprimentos de onda apropriados, os pontos quânticos ligados a anticorpos secundários retornam ao estado fundamental e emitem sinais fluorescentes específicos que são detectados pelo fotodetector.

A intensidade de fluorescência pontual quantifica o isotipo de anticorpo sérico dentro do soro ligado ao antígeno individual.

Depois de programar o software de impressão com o protocolo desejado, inicie a impressão. Quando concluído, coloque as lâminas de microarray não sondadas em uma caixa à prova de luz em um gabinete dessecador em temperatura ambiente.

Para sondar soros em busca de anticorpos no microarray, use clipes para prender o lado da almofada de lâminas do microarray para cima nas câmaras de sondagem e coloque as câmaras nas estruturas.

Tenha cuidado ao montar as lâminas, pois elas se quebram facilmente, e verifique se há vazamento após a reidratação. Se necessário, desmonte e remonte as corrediças para consertar vazamentos.

Reidrate as lâminas com 100 microlitros de tampão de bloqueio filtrado por poço e dilua os soros na proporção de 1 para 100 em 100 microlitros de tampão de bloqueio por amostra. Em seguida, incubar as lâminas de microarranjo reidratadas e os soros diluídos durante 30 minutos à temperatura ambiente e 100 a 250 rotações por minuto num agitador orbital.

No final da incubação, utilizar ponteiras de pipeta ligadas a uma linha de vácuo com um balão de recolha secundário para aspirar cuidadosamente o tampão de bloqueio do canto de cada câmara sem tocar nas almofadas e adicionar imediatamente os soros diluídos às almofadas sem permitir que sequem. Em seguida, coloque as molduras cobertas em bandejas contendo toalhas de papel úmidas seladas para manter a umidade e incube as molduras durante a noite a 4 graus Celsius em um agitador de balanço.

Para a marcação de anticorpos secundários conjugados com pontos quânticos, aspire cuidadosamente os soros, como acabamos de demonstrar, e enxágue as lâminas com três lavagens em 100 microlitros de tampão T-TBS fresco por poço por 5 minutos cada em um agitador orbital. As lâminas são então incubadas com uma mistura de anticorpos secundários conjugados com pontos quânticos e, em seguida, lavadas três vezes conforme descrito no protocolo, usando a mesma técnica demonstrada.

Após a última lavagem, remova cuidadosamente as lâminas das câmaras e lave-as suavemente com água bidestilada filtrada e, em seguida, coloque cada lâmina em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, seque as lâminas por centrifugação.

Para adquirir imagens das lâminas de microarray, primeiro ligue o gerador de imagens portátil e coloque cuidadosamente a lâmina a ser fotografada com a face para baixo no suporte de lâminas na câmara de imagem. Abra o software de imagem e, na guia "Configurar Imager", selecione a configuração de slide apropriada.

No separador "Controlo de imagem", selecione o canal fluorescente adequado e ajuste os tempos de exposição e aquisição, dependendo da reatividade dos soros. Em seguida, clique em 'Capturar' para iniciar a aquisição da imagem. Ao final da aquisição, use as grades orientadas nos marcadores fiduciais para detectar os pontos da matriz.