JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 3:05 min • July 8th, 2025
Os monócitos são células imunes que se diferenciam em macrófagos e células dendríticas apresentadoras de antígenos para proteger contra infecções.
Para cultivar monócitos e induzir sua diferenciação in vitro, comece por tomar uma suspensão de monócitos humanos primários em um meio de cultura adequado. Adicione a suspensão celular nos poços de uma placa de cultura. Incubar em condições fisiológicas para permitir que as células adiram.
Adicione citocinas indutoras de diferenciação - fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos, ou GM-CSF, a um poço e fator estimulador de colônias de macrófagos, ou M-CSF, a outro. Incubar por um período apropriado.
O GM-CSF se liga ao seu receptor heterodimérico nas células e induz a diferenciação dos monócitos. A ligação GM-CSF resulta na ativação de vias de sinalização intracelular, levando à expressão de genes para priming em um fenótipo semelhante a macrófagos M1.
As células semelhantes a M1 - células arredondadas com grande volume citoplasmático - são pró-inflamatórias e auxiliam na defesa contra infecções.
No outro poço, o M-CSF se liga ao seu receptor homodimérico nos monócitos e induz a diferenciação das células. A ligação ao M-CSF resulta na ativação de vias de sinalização intracelular diferentes do GM-CSF, levando à expressão de genes para priming em um fenótipo semelhante ao macrófago M2.
As células semelhantes a M2 - com uma forma alongada - são anti-inflamatórias e exibem funções de remodelação e reparo de tecidos.
As células de macrófagos diferenciadas estão prontas para outros ensaios a jusante.
Após a contagem, ressuspenda os monócitos isolados em 1 vezes 10 elevado às sextas células por mililitro de meio RPMI 1640 sem soro de 37 graus Celsius suplementado com antibióticos e coloque 1 mililitro de células ressuspensas em placas de 35 milímetros em um gabinete de biossegurança. Em seguida, coloque as placas na incubadora de cultura de células por 30 a 60 minutos para permitir que as células adiram ao fundo do poço.
Para preparar macrófagos com fenótipo semelhante ao M1, adicione 100 microlitros de soro fetal bovino contendo 25 nanogramas por mililitro de GM-CSF a cada placa. Para preparar macrófagos com fenótipo semelhante ao M2, adicione 100 microlitros de bovino fetal contendo 50 nanogramas por mililitro de M-CSF a cada placa.