Isolamento de linfócitos de um adesivo de Peyer de camundongo
JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
0 vistas • 6:02 min • July 8th, 2025
As placas de Peyer, PPs, agregados de tecidos linfóides organizados na parede do intestino delgado, contêm células imunes, incluindo linfócitos B, linfócitos T, células dendríticas e macrófagos.
Para isolar linfócitos de PPs de camundongos, comece com um camundongo sacrificado. Incisar a parede abdominal, expondo a cavidade peritoneal. Localize o ceco. Dissecar a junção ileocecal para separar o ceco do intestino delgado.
Extirpar o mesentério e incisar o intestino delgado no duodeno para remover o intestino delgado da cavidade peritoneal. Coloque o intestino delgado em uma placa de vários poços contendo meio resfriado e enxágue para remover os detritos.
Posicione o intestino delgado com o lado mesentérico voltado para baixo e umedeça com meio para manter a hidratação do tecido. Identifique os PPs - agregados brancos multilobulados no lado antimesentérico da parede intestinal.
Extirpar cuidadosamente os PPs, excluindo o tecido intestinal circundante. Transferir para um tubo contendo meio. Incubar sob agitação constante. Esta etapa de agitação separa o muco, detritos celulares e qualquer matéria fecal dos PPs, melhorando assim a recuperação dos linfócitos PP.
Em seguida, transfira o tecido para um filtro de células com um tamanho de malha apropriado. Interrompa suavemente os PPs e libere as células. Lave com meio através do filtro para obter uma suspensão de linfócitos de célula única. Centrifugue a suspensão a uma temperatura baixa para manter a estabilidade da célula.
Ressuspenda os linfócitos em meio e use para análise posterior.
Comece colocando um camundongo em decúbito dorsal e esterilizando o abdômen com etanol a 70%. Faça uma incisão abdominal na linha média através da pele e do peritônio do púbis até a caixa torácica para abrir a cavidade peritoneal e localizar o ceco e a junção ileocecal.
Faça o corte o mais distal possível, na junção para separar o intestino delgado do ceco, e corte o mesentério com uma tesoura para remover cuidadosamente todo o intestino delgado até o esfíncter pilórico.
Corte a junção entre o piloro e o duodeno para separar completamente o intestino delgado da cavidade abdominal e coloque o intestino delgado isolado em um poço de uma placa de seis poços contendo meio RPMI frio, suplementado com 10% de soro fetal bovino ou FBS no gelo. Em seguida, agite suavemente os tecidos manualmente até que todos os segmentos estejam submersos no meio frio.
Quando todos os intestinos tiverem sido colhidos, use uma pinça para agarrar a gordura mesentérica de uma borda do intestino e coloque a amostra - lado mesentérico para baixo - em uma toalha de papel. Umedeça todo o segmento intestinal com RPMI mais 10% de FBS para evitar desidratação e viscosidade do tecido e localize as manchas de Peyer, que aparecem como agregados multilobulados brancos com formato de couve-flor no lado antimesentérico da parede intestinal.
Para colher os adesivos de Peyer, use uma tesoura cirúrgica curva com a curva voltada para cima para extirpar suavemente cada adesivo de suas bordas distal e proximal, tomando cuidado para excluir o tecido intestinal circundante, e coloque os adesivos de Peyer em poços individuais de uma placa de 12 poços contendo RPMI gelado mais 10% de FBS, no gelo, à medida que são coletados.
Quando todos os adesivos tiverem sido adquiridos, use uma tesoura para cortar a ponta de uma ponta de micropipeta de 1 mililitro para que o diâmetro seja grande o suficiente para aspirar os adesivos de Peyer individuais e transfira os adesivos de Peyer para um tubo cônico de 150 mililitros por camundongo, contendo 25 mililitros de RPMI de 37 graus Celsius mais 10% de FBS.
Em seguida, coloque os tubos em um agitador orbital a 37 graus Celsius com agitação contínua de 125 a 150 RPM por 10 minutos. No final da agitação, transfira os adesivos de Peyer para um filtro de células de 140 micrômetros por camundongo e use a extremidade de borracha do êmbolo de seringa de 110 mililitros por animal para romper suavemente os adesivos de Peyer através da malha em tubos cônicos individuais de 50 mililitros.
Enxágue os filtros com 15 a 20 mililitros de RPMI frio mais 10% de FBS e colete as células por centrifugação. Depois de descartar cuidadosamente o sobrenadante, ressuspenda novamente as células a aproximadamente 1 x 107 células por mililitro de RPMI mais 10% de concentração de FBS para contagem. Em seguida, transfira 2 para 2,5 x 106 células por 200 microlitros de meio, para cada poço de uma placa inferior redonda de 96 poços, e pelete as células por centrifugação.
Visão Geral
Este artigo detalha o isolamento de linfócitos de placas de Peyer (PPs) no intestino delgado de camundongos. O procedimento envolve a dissecação cuidadosa e a manipulação de tecidos intestinais para obter uma suspensão viável de células para análises posteriores.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Biologia Celular
- Neurociência
Antecedentes
- As placas de Peyer são tecidos linfoides organizados essenciais para a resposta imune.
- Elas contêm diversos tipos de células imunes, incluindo linfócitos B e T.
- O isolamento dessas células é essencial para o estudo das funções imunológicas.
- A metodologia requer técnicas cirúrgicas precisas para evitar contaminação.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de placas de Peyer de camundongo.
- Aumentar a recuperação de linfócitos viáveis para fins de pesquisa.
- Facilitar estudos adicionais sobre respostas imunes no intestino.
Métodos Utilizados
- Eutanasiar o camundongo e realizar uma incisão abdominal mediana.
- Dissecar o intestino delgado e identificar as placas de Peyer.
- Utilizar agitação para destacar as células das placas.
- Filtrar e centrifugar para obter uma suspensão de células simples.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de linfócitos de placas de Peyer.
- Melhoria nas taxas de recuperação de células viáveis por meio de técnicas otimizadas.
- Estabelecimento de um protocolo reprodutível para estudos futuros.
Conclusões
- O método descrito é eficaz para o isolamento de linfócitos de PP.
- Este protocolo pode auxiliar na compreensão da imunidade intestinal.
- Aplicações futuras podem incluir estudos sobre respostas imunes e terapias.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de linfócitos de placas de Peyer de camundongos permite a desmistificação mecanicista de alvos no tecido linfóide associado ao intestino (GALT) no desenvolvimento de vacinas imunológicas e mucosas. Este protocolo auxilia na validação de alvos ao fornecer uma fonte reprodutível de linfócitos B e T primários para ensaios funcionais, reduzindo a ambiguidade biológica no estágio inicial de descoberta. O método aumenta a confiabilidade preditiva em modelos pré-clínicos, garantindo suspensões celulares viáveis e livres de contaminação para análises posteriores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas na imunidade intestinal mediante o isolamento de linfócitos a partir de tecido linfóide organizado.
- Valor Operacional: Fornece um protocolo padronizado de dissociação tecidual que melhora a recuperação e a viabilidade de linfócitos.
- Valor Estratégico: Apoia a redução de riscos em alvos terapêuticos por meio da validação funcional das respostas de células imunes em um sistema relevante para a doença.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera suspensões de linfócitos de célula única adequadas para citometria de fluxo, perfilagem de citocinas e ensaios de triagem funcional.
- Valor Operacional: Utiliza filtração e centrifugação em baixa temperatura para manter a estabilidade celular e garantir a reprodutibilidade dos ensaios.
- Valor Estratégico: Permite o preparo escalonável de células imunes primárias para triagem de alto conteúdo e alinhamento de biomarcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem relevante para doenças das respostas imunes mucosas ao fornecer linfócitos primários de placas de Peyer.
- Valor Operacional: Estabelece um fluxo de trabalho contínuo da colheita do tecido até a suspensão celular, para uso em estudos de validação pré-clínica.
- Valor Estratégico: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco, permitindo leituras mecanicistas na imunomodulação direcionada ao intestino.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O protocolo de isolamento de linfócitos integra-se ao continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a validação pré-clínica, apoiando pipelines de desenvolvimento de medicamentos com foco imunológico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias no tecido linfóide associado ao intestino ao fornecer células imunes primárias.
- Triagem: Fornece suspensões de linfócitos prontas para ensaio com rendimentos quantificados para avaliação reprodutível de compostos ou estímulos.
- Análises: Permite medições quantitativas de variáveis dependentes, como contagem de células, viabilidade e distribuição de subpopulações, para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica mediante o uso de linfócitos primários em ensaios imunológicos funcionais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de dissociação de tecidos aplicável a projetos de imunologia e terapias mucosas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio do uso de linfócitos primários provenientes de um tecido linfóide fisiologicamente relevante.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de etapas definidas de dissecação, agitação, filtração e centrifugação.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de avançar ou interromper projetos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em programas precoces de imunologia.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de imunomoduladores direcionados ao intestino com base na função validada de linfócitos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em anatomia murina e dissecção estéril de tecidos para isolar as placas de Peyer sem contaminação.
- Depende de agitador orbital, peneiras para células e equipamentos de centrifugação mantidos em temperaturas controladas.
- Necessita padronização entre as equipes quanto ao manuseio de tecidos, duração da agitação e protocolos de ressuspendimento celular.
- As considerações para adaptação incluem a seleção do tamanho da malha e a composição do meio para diferentes linhagens de camundongos ou condições dos tecidos.
- As limitações práticas incluem a variabilidade no rendimento tecidual e a necessidade de processamento imediato para manter a viabilidade dos linfócitos.
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Última atualização: 29 agosto 2026