JoVE Encyclopedia of Experiments
Imunologia
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Para induzir uma resposta imune, as células dendríticas, DCs, apresentam um antígeno exibido com MHC classe II e as moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86. Com base nas características da resposta imune, eles são subdivididos em DCs imaturos, maduros e tolerogênicos.
Para gerar vários subconjuntos de células dendríticas in vitro, comece com uma placa de vários poços contendo monócitos humanos - células precursoras imunes em um meio completo contendo fatores de crescimento e a citocina IL-4 - uma molécula de sinalização.
Incube as células por um período prolongado. Os fatores de crescimento e IL-4 induzem a proliferação e diferenciação de monócitos em DCs imaturas.
DCs imaturos possuem receptores de reconhecimento de padrões, PRRs e expressam moléculas de baixo MHC classe II e co-estimulatórias, exibindo uma capacidade diminuída de provocar uma resposta imune.
Trate um poço contendo DCs imaturos com agentes imunomoduladores - vitamina D3 e glicocorticóides. Esses agentes imunomoduladores regulam negativamente a expressão de moléculas MHC classe II e co-estimulatórias. Isso leva à diferenciação em DCs tolerogênicas - células imunorreguladoras que previnem respostas imunes exageradas ou indesejáveis.
Trate outro poço contendo DCs imaturas com lipopolissacarídeo, LPS - um antígeno. O LPS interage com o receptor-4 toll-like das células - um PRR, inicia uma cascata de sinalização e as diferencia em células maduras. Essas células expressam alto MHC classe II, moléculas co-estimulatórias e PRRs - eficientes para processamento e apresentação de antígenos.
Observe os poços tratados diferencialmente para características morfológicas distintas que representam os subtipos de células dendríticas.
Semear quatro conjuntos de monócitos CD14+ em uma concentração de 0,3 a 0,5 x 10,6 por mililitro de meio de cultura celular de IL-4 em placas de seis poços. Incubar as células em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius com 5% de CO2. No dia 4, remova 850 microlitros de meio da cultura e centrifugue.
Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 mililitro de meio de cultura celular. Adicione a mistura de células de volta à cultura. No dia 5, adicione 1 microlitro de caldo de vitamina D3 e 1 microlitro de caldo de dexametasona por mililitro de meio a dois dos conjuntos para gerar moDCs tolerogênicos.
No dia 6, adicione 200 nanogramas por mililitro de GM-CSF e 200 nanogramas por mililitro de IL-4 a todos os conjuntos. Adicionar 1 micrograma por mililitro de LPS a um dos conjuntos tratados apenas com GM-CSF e IL-4 para gerar moDCs maduros.
Adicione 1 micrograma por mililitro de LPS a um conjunto de moDCs de modos tolerogênicos para gerar moDCs tolerogênicos a LPS. Finalmente, no dia 7, colha os diferentes tipos de moDCs lavando a placa de cultura com PBS-EDTA.