Isolamento e purificação de células B do sangue periférico humano

Para realizar a separação imunomagnética negativa das células B, colete sangue periférico humano em um tubo contendo anticoagulante para evitar a coagulação do sangue. Adicione glóbulos vermelhos, hemácias, tampão de lise para lisar as hemácias sem afetar outras células sanguíneas.

Centrifugue para sedimentar as células sanguíneas intactas e mais densas das hemácias menos densas, que permanecem no sobrenadante. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em meio fresco.

Transfira as células para uma placa de cultura. Incubar para permitir que os macrófagos e monócitos adiram à placa enquanto as células não aderentes, incluindo as células B, permanecem em suspensão.

Recolher as células em suspensão para um novo tubo. Centrifugue para pellet as células e ressuspenda-as em um tampão.

Adicionar uma solução de cocktail contendo anticorpos biotinilados específicos para células sanguíneas que não sejam células B. Os anticorpos se ligam a antígenos na superfície de células não B, deixando as células B sem marcação.

centrifuga. Rejeitar o sobrenadante que contém anticorpos não ligados.

Adicione uma solução de esferas magnéticas conjugadas com estreptavidina. Durante a incubação, a estreptavidina nas microesferas liga-se fortemente aos anticorpos biotinilados ligados a células não-B, formando complexos.

Coloque o tubo em um campo magnético para aderir as células não-B ligadas a esferas magnéticas às paredes do tubo, deixando as células B em suspensão. Transfira o sobrenadante contendo células B puras para um tubo.

Centrifugue e ressuspenda as células B em meio para posterior análise a jusante.

Imediatamente após obter uma amostra de sangue de 10 mililitros da veia cubital mediana em um tubo de 15 mililitros contendo EDTA suplementado com potássio, inverta o tubo várias vezes para evitar a formação de coágulos. Em seguida, adicione 35 mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos autoclavado às células para uma incubação de 5 minutos em temperatura ambiente.

Quando a luz puder ser observada através do tubo, centrifugue o sangue e confirme a presença de um pellet branco. Remova o tampão de lise residual com 10 mililitros de autoclave para PBS e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio RPMI 1640.

Coloque as células em uma placa de cultura de 10 centímetros para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, gire suavemente a placa de cultura algumas vezes e transfira as células flutuantes para um tubo cônico de plástico de 15 mililitros.

Após duas lavagens por centrifugação, ressuspenda o pellet em uma concentração de 5 a 10 x 10⁶ células por mililitro em 200 microlitros de tampão PBS frio e adicione 5 microlitros de coquetel de anticorpos anti-humanos biotinilados específicos para células sanguíneas por 1 x 10⁶ células.

Após uma incubação de 30 minutos no gelo, lave as células em um volume 10 vezes maior de PBS estéril e ressuspenda o pellet em 5 microlitros de microesferas conjugadas com estreptavidina por 1 x 10⁶ células para uma incubação de 30 minutos no gelo. No final da incubação, adicione 2 mililitros de tampão PBS às células e coloque o tubo em um suporte magnético por 8 minutos em temperatura ambiente.

Quando as microesferas estiverem presas à parede do tubo, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo cônico e adicione mais 2 mililitros de tampão PBS às células. Após a segunda coleta de sobrenadante, colete as células agrupadas por centrifugação e transfira as células para um tubo de poliestireno de 5 mililitros em tampão PBS fresco a uma concentração de 1 x 10⁷ células por mililitro.