Avaliação funcional de células B secretoras de anticorpos usando o ensaio ELISpot

As células B secretoras de anticorpos, ou ASCs, são células B diferenciadas que secretam isotipos de anticorpos, incluindo IgG e IgM, para garantir proteção contra patógenos.

Para realizar uma avaliação funcional das ASCs in vitro, comece com o ensaio de ponto de imunoabsorção enzimática. Pegue uma placa ELISpot contendo uma membrana de fluoreto de polivinilideno ativado na base.

Incubar os poços com fragmentos de anticorpos policlonais contendo exclusivamente regiões Fab sem a região Fc do anticorpo. Cada região Fab tem um local de ligação para isotipos específicos de anticorpos - IgG ou IgM, permitindo a identificação de ambos os isotipos.

Durante a incubação, os fragmentos de anticorpos se ligam à membrana, levando à imobilização.

Cubra os poços com soluções de bloqueio para evitar ligações não específicas. Semeie a placa com células B secretoras de anticorpos ativadas e incuba. Os ASCs secretam diferentes isotipos, incluindo IgG e IgM, que se ligam aos fragmentos de anticorpos ligados à membrana.

Lave a placa com um tampão para remover os anticorpos secretados não ligados. Trate alguns poços com anticorpos de detecção conjugados com enzimas para IgM e outros com anticorpos de detecção para IgG e incuba.

Os anticorpos de detecção se ligam aos seus respectivos isotipos, formando imunocomplexos.

Adicione substratos colorimétricos a todos os poços, que interagem com as enzimas e produzem manchas roxas na membrana. Adicione uma solução de parada para interromper a reação.

A mancha colorida produzida em cada poço indica a presença do isotipo do anticorpo específico, correlacionando-se com a atividade secretora das células B.

Quando todas as células tiverem sido colhidas, semeie os subconjuntos em poços individuais de uma placa de cultura de células de 12 poços em uma concentração de 1 a 10 x 10⁵ células por mililitro em meio RPMI fresco. Em seguida, ative as células B com 5 microgramas de CpG (ODN 2006) por 1 x 10⁶ células por mililitro por poço na incubadora de cultura de células por cinco dias.

Ao final da ativação, adicione 30 microlitros de etanol a 35% em água destilada a cada poço das placas ELISpot por 30 segundos. Em seguida, substitua o etanol em cada poço por 150 microlitros de água bidestilada autoclavada e incube as placas em temperatura ambiente por 5 minutos para remover o etanol residual. Realize uma lavagem com PBS, seguida pela adição de 50 microlitros do fragmento policlonal F(ab')2 de Ig anti-humano a cada poço.

Lave as placas duas vezes com PBS, como acabamos de demonstrar. Bloqueie a ligação não específica em cada poço com 200 microlitros de PBS fresco com BSA por duas horas em temperatura ambiente. Após outra série de lavagem PBS, incube os poços em 100 microlitros de meio RPMI 1640 fresco a 37 graus Celsius. Em seguida, substitua o meio em cada ELISpot pelo número apropriado de células B ativadas.

Traga o volume final de cada poço para 150 microlitros com meio RPMI fresco. Em seguida, devolva a placa ELISpot à incubadora de cultura de células por 8 a 14 horas. No final do período de incubação, descarte o meio e lave os poços com 200 microlitros de PBS mais Tween 20 por cinco lavagens de 3 minutos.

Após a última lavagem, adicione os anticorpos de detecção apropriados aos poços correspondentes e incube as placas por duas horas no escuro. Após outra série de lavagem PBS, adicione 50 microlitros de substrato BCIP/NBT a cada poço por 5 a 15 minutos em temperatura ambiente.

Quando aparecerem manchas roxas, interrompa a reação com 100 microlitros de água bidestilada por poço e enxágue a placa com água corrente da torneira. Em seguida, seque ao ar as membranas ELISpot protegidas da luz.