Isolamento e cultura de células estromais da medula óssea de uma tíbia de camundongo

As células estromais da medula óssea, BMSCs - progenitores de linhagens de tecido esquelético - residem dentro da cavidade da medula óssea junto com uma população de células heterogêneas, incluindo células-tronco hematopoiéticas, HSCs e células sanguíneas diferenciadas.

Para isolar BMSCs, comece com uma tíbia de camundongo recém-colhida. Corte as extremidades proximal e distal do osso para expor a cavidade da medula óssea. Coloque o osso cortado em um tubo de microcentrífuga adaptado contendo meio.

Centrifugue em alta velocidade para remover a medula óssea do osso e formar um pellet de medula óssea no fundo do tubo. Remova o osso do tubo. Usando uma agulha presa a uma seringa, triture a medula óssea para quebrar os aglomerados.

Adicione meio à suspensão. Filtre através de um filtro de células de tamanho de malha apropriado para remover os fragmentos ósseos. Colocar o filtrado que contém as células da medula óssea numa placa de cultura de plástico.

Durante a incubação pelo período adequado, as BMSCs aderem ao fundo da placa de cultura plástica e proliferam, enquanto as células não aderentes, incluindo HSCs, permanecem em suspensão.

Descarte o meio que contém as células não aderentes. Use tripsina para separar os BMSCs da placa. Adicione meio contendo soro para inativar a tripsina. Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda as BMSCs em um meio fresco e semeie as células em uma placa de cultura. Incubar, permitindo que os BMSCs adiram à placa e formem uma monocamada.

Quando todos os ossos tiverem sido coletados, coloque as amostras em PBS no gelo e transfira as amostras para uma capela de cultura estéril. Usando técnica estéril, faça cortes de 1 a 2 milímetros nas extremidades proximal e distal de cada osso antes de colocar três ossos em cada ponta de micropipeta modificada nos tubos de microcentrífuga.

Colha a medula óssea dos ossos por centrifugação, confirmando que a medula foi completamente peletizada no fundo de cada tubo de microcentrífuga no final da centrifugação. Se toda a medula tiver sido coletada, os ossos parecerão brancos. Remova as pontas da micropipeta e os ossos dos tubos de coleta para descarte adequado de biossegurança.

Para plaquear as células da medula óssea, primeiro use uma seringa de 1 mililitro equipada com uma agulha de calibre 25 para ressuspender lentamente os grânulos e quebrar quaisquer aglomerados, e agrupe as amostras em um único tubo cônico de 15 mililitros. Adicione 10 mililitros de meio de cultura de células-tronco da medula óssea por 500 microlitros de amostra e filtre a suspensão celular através de um filtro de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros para remover quaisquer fragmentos ósseos.

Para plaquear uma cultura populacional de células de medula óssea dividida, coloque as células da medula óssea colhidas de um camundongo em uma placa de cultura de células de 10 centímetros por 48 horas em meio de cultura fresco em uma incubadora de cultura de células.

No segundo dia de cultura, remova o sobrenadante contendo células-tronco hematopoiéticas não aderentes e lave cuidadosamente a placa com PBS sem perturbar as células aderentes da medula óssea. Substitua o PBS por 0,25% de tripsina. Após 1 a 3 minutos a 37 graus Celsius, extinguir a reação com meio de cultura de células frescas e contar as células na suspensão celular resultante.

Centrifugue o número apropriado de células para o plaqueamento e ressuspenda o pellet em meio de cultura fresco suficiente para a densidade de revestimento desejada. Em seguida, coloque as placas na incubadora de cultura de células até a confluência.