Cultura de células T ativadas de células mononucleares do sangue periférico humano

Múltiplas interações receptor-ligante de superfície celular entre células T virgens e células apresentadoras de antígenos, APCs, provocam ativação e proliferação de células T.

Os dois eventos primários neste processo envolvem o reconhecimento do antígeno expresso em APC pelo complexo receptor de células T CD3, seguido pela interação entre o ligante B7 expresso em APC e o receptor de células T CD28.

Para estudar a ativação e proliferação de células T in vitro, tomar células mononucleares do sangue periférico humano, PBMCs, suspensas em um meio de cultura adequado. Adicione esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 e divida as células em dois tubos cônicos.

Adicione a citocina interleucina-2, IL-2, ao primeiro tubo e a interleucina-15, IL-15, ao outro. Transfira as células para uma placa de vários poços. Incubar.

Os anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 das esferas ligam-se ao complexo receptor de células T CD3 e ao receptor CD28 expresso nas células T, respectivamente, causando ativação e proliferação de células T.

Com a IL-2, a citocina se liga ao seu receptor na superfície das células T ativadas, levando à sua diferenciação e proliferação em células T efetoras. Por outro lado, a IL-15 impulsiona principalmente a diferenciação e proliferação de células T em células T de memória.

Ressuspenda e transfira metade das células para novos poços para permitir o crescimento celular. Adicione meio fresco contendo IL-2 ou IL-15 para manter as populações de células T diferenciadas por citocinas para análise subsequente.

Para começar, lave os grânulos CD3 / CD28 transferindo 12,5 microlitros de grânulos por milhão de células para um tubo de microcentrífuga e adicionando 12,5 microlitros de PBS por 12,5 microlitros de grânulos no tubo. Em seguida, coloque o tubo de microcentrífuga em um ímã adequado por 1 minuto, descarte o tampão e ressuspenda os grânulos no volume original do meio de células T.

Em seguida, adicione 12,5 microlitros de grânulos por milhão de células em uma proporção de 1 a 2 grânulos por células e divida as células em duas condições com cerca de 5 milhões de células em cada uma. Em seguida, adicione o volume correto de citocinas a cada condição e transfira as células para placas de vários poços. Incube as células por três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após três dias de incubação, prepare o meio de células T fresco com o dobro da concentração de citocinas. Ressuspenda e divida as células transferindo metade do volume de cada poço para um novo poço. Em seguida, adicione o mesmo volume de meio de células T recém-preparado a cada poço.