Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 3:42 min. • July 8th, 2025
Os leucócitos hepáticos marginais, HM, são encontrados aderidos às paredes dos vasos sanguíneos hepáticos especializados ou sinusóides, que são revestidos por células endoteliais. Os leucócitos HM são recrutados para o tecido circundante em resposta à inflamação.
Para colher leucócitos MH, comece com um camundongo sacrificado em decúbito dorsal. Incisar as cavidades peritoneal e torácica, expondo o fígado e o complexo cardiopulmonar.
Deslocar os intestinos para expor a veia porta, que transporta sangue do baço, trato gastrointestinal e seus órgãos associados para o fígado. Insira uma agulha conectada a uma bomba peristáltica na veia porta.
Disseque a veia cava inferior - um grande vaso sanguíneo que transporta sangue desoxigenado do fígado para o coração - para coletar o perfusato durante a perfusão.
Perfunda o fígado através da veia porta com tampão contendo anticoagulante em baixa taxa de fluxo por um curto período. Esta etapa ajuda a remover o sangue com células não aderentes dos vasos sanguíneos do fígado através do fluxo de saída da veia cava inferior. Descarte este perfusado contaminado com sangue.
Agora, perfunda em uma taxa de fluxo mais alta. A perfusão forçada em um fluxo aumentado e taxas de cisalhamento interrompe a adesão entre os leucócitos HM e o revestimento interno dos vasos sanguíneos, destacando assim os leucócitos MH da parede sinusoidal.
Colete e transfira o perfusato contendo leucócitos MH e outras células sanguíneas para um novo tubo. Centrifuga. Ressuspenda o pellet contendo leucócitos MH para posterior análise a jusante.
Para coletar leucócitos hepáticos marginais de camundongos, imediatamente após a cessação da respiração, use tesouras estéreis e pinças de tecido dentário para fazer uma incisão abdominal na linha média até o processo xifóide. Em seguida, use a pinça para levantar o esterno e corte cuidadosamente o diafragma e a caixa torácica em ambos os lados.
Prenda um hemostático no esterno e dobre a caixa torácica rostralmente para expor o complexo cardiopulmonar. Mova os intestinos para fora da cavidade abdominal para a esquerda do animal, expondo a veia porta. Em seguida, conecte uma agulha de calibre 30 a uma bomba peristáltica e insira-a na veia porta, rostral à veia esplênica.
Corte a veia cava inferior acima do diafragma para permitir a drenagem e coleta do perfusato da cavidade torácica. Em seguida, ligue a bomba peristáltica a uma velocidade de aproximadamente 3 mililitros por minuto e colete os primeiros mililitros de perfusato contaminado com sangue da piscina da cavidade torácica. Quando 3 mililitros tiverem sido coletados, desligue a bomba.
Em seguida, após inserir uma agulha borboleta de calibre 21 conectada a uma seringa de 10 mililitros, reinicie a perfusão a uma velocidade de até 4 mililitros por minuto até que 10 mililitros de perfusato sejam coletados da cavidade torácica. Quando o fígado ficar marrom claro, interrompa a perfusão. Em seguida, transfira o perfusato para um tubo de 15 mililitros. Centrifugue-o e, em seguida, aspire o sobrenadante.