Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Imunologia
0 visualizações • 5:07 min. • July 8th, 2025
Os megacariócitos são células grandes e multinucleadas que dão origem às plaquetas, essenciais para a coagulação do sangue.
Para produzir plaquetas in vitro, faça uma cultura em suspensão de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, HSPCs, derivadas do sangue do cordão umbilical humano.
Adicione trombopoetina e incube em condições fisiológicas. A trombopoetina se liga ao seu receptor nas HSPCs, desencadeando eventos de sinalização que levam à diferenciação das HSPCs em megacariócitos imaturos.
As células imaturas passam por um processo de maturação para formar megacariócitos amadurecidos. As células amadurecidas são grandes e contêm grânulos secretores citoplasmáticos. Eles possuem um núcleo poliplóide multiplóide e um sistema de membrana invaginada no citoplasma.
Megacariócitos amadurecidos produzem extensões citoplasmáticas longas e finas - proplaquetas. As proplaquetas - vários inchaços do tamanho de plaquetas ligados por finas pontes citoplasmáticas - são liberadas no meio.
As pontes citoplasmáticas se rompem, causando a liberação de plaquetas individuais. Centrifugue para obter as plaquetas como um pellet. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um tampão contendo difosfato de adenosina - para ativação plaquetária - e anticorpos marcados com fluorescência - para identificar as plaquetas ativadas.
O difosfato de adenosina se liga a receptores específicos acoplados à proteína G nas plaquetas. A ligação inicia uma cascata de sinalização, levando à ativação plaquetária. A ativação induz a sinalização intracelular que ativa um complexo de integrina na membrana plaquetária. Os anticorpos marcados com fluorescência se ligam ao complexo ativado.
Analise as células usando citometria de fluxo. A presença de um sinal de fluorescência específico para anticorpos indica plaquetas ativadas.
Para diferenciação de megacariócitos, semear 5 x 105 células CD34 positivas por mililitro em 2 mililitros de meio livre de soro, suplementado com trombopoetina humana recombinante por poço, em uma placa de 12 poços para sua incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma atmosfera umidificada.
Nos pontos de tempo de monitoramento de diferenciação apropriados, colha as células de dois a três poços por ponto de tempo sem perturbar as células nos outros poços e cove as células coletadas com anticorpos anti-CD41 e anti-CD42a para determinar a porcentagem de megacariócitos maduros nas culturas.
Para visualização microscópica dos marcadores de superfície celular, lave as células colhidas em 1 mililitro de tampão de separação e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão fresco. Use um citospin para semear as células em uma lâmina de vidro e fixe as células na lâmina com uma submersão de 30 segundos em metanol. Após a secagem ao ar, rotule as células com 20 microlitros de meio de montagem suplementado com DAPI e cubra as células com uma lamínula para visualização por microscopia fluorescente.
Para contar as plaquetas, colha as células no dia 8 ou 9 de diferenciação e semeie as células coletadas em 1 x 104 células por 200 microlitros de meio fresco livre de soro suplementado com trombopoetina humana recombinante por poço em uma placa de 48 poços. Após 5 dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, conte o número de megacariócitos portadores de plaquetas por poço em um microscópio de luz invertida usando a objetiva de 10 ou 20 vezes.
Para analisar a ativação plaquetária, no dia 14 ou 15 de cultura, misture suavemente as células com uma pipeta Pasteur e colete 100 microlitros de células. Adicione 1 mililitro de tampão de Tyrode às células e pelete-as por centrifugação. Colete o sobrenadante para centrifugação para granular as partículas do tamanho de plaquetas e ressuspenda as partículas em 100 microlitros de tampão de Tyrode fresco. Em seguida, rotule as partículas com anticorpo anti-PAC-1. Ative-os com difosfato de adenosina por 20 minutos em temperatura ambiente e analise a porcentagem de eventos positivos para PAC-1 por citometria de fluxo.