Expansão ex vivo de células assassinas naturais de células mononucleares do sangue periférico

As células natural killer, NK, são grandes linfócitos granulares que eliminam tumores e infecções microbianas.

Para expansão ex vivo das células NK, tomar uma suspensão de células mononucleares do sangue periférico, PBMCs, contendo uma população heterogênea de linfócitos, incluindo células NK. Adicione células alimentadoras irradiadas - células linfoblastóides não proliferativas - que expressam interleucina 21 ligada à membrana, mIL-21, necessária para ativar e expandir as células NK.

Adicione a co-cultura em um poço de cultura especializado com uma membrana permeável a gás na parte inferior, permitindo a troca gasosa. As células se estabelecem e proliferam por um longo período sem a necessidade de passagem.

Adicione interleucina 2, IL-2 e interleucina 15, IL-15 - citocinas para proliferação de células NK. Incubar por um período adequado em condições fisiológicas.

A mIL-21 nas células alimentadoras se liga a um receptor heterodimérico específico nas células NK. IL-15 e IL-2 exógenas se ligam a seus respectivos receptores. A ligação induz diferentes vias de sinalização a jusante - ativando a expressão gênica - limitando a senescência celular e levando à proliferação prolongada de células NK.

Usando citometria de fluxo, avalie a expansão das células NK em intervalos de tempo regulares.

Plote os dados registrados para analisar a taxa de expansão das células e sua pureza - crescimento seletivo do tipo de célula NK alvo. A expansão do coletor ao longo do período de incubação indica uma proliferação sustentada, mantendo alta pureza.

Lave as células mononucleares do sangue periférico, ou PBMCs, e 100 células de 221 mIL-21 irradiadas com gama separadamente por centrifugação a 400 g por 5 minutos com 10 mililitros de meio R-10.

Após a centrifugação, guarde 1 x 10⁶ PBMCs para citometria de fluxo e misture 5 x 10⁶ PBMCs com 10 x 10⁶ 100 células de 221 mIL-21 irradiadas com gama em uma placa especial de 6 poços. Adicione 30 mililitros de meio R-10 suplementado com interleucina-2 humana e interleucina-15 humana à mesma placa de 6 poços e incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono com substituição do meio a cada três a quatro dias.

Durante a incubação, registre o número total de células assassinas naturais do sangue periférico ou PBNK, a viabilidade e realize a citometria de fluxo a cada três a quatro dias para calcular a taxa de expansão das células NK.